铜胁迫对葡萄根系活性氧和抗氧化酶活性的影响

关利平，张伟，王紫寒，邵小杰

（山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

葡萄（Vitis viniferaL.）是世界性的重要果树，也是我国的大宗果品。据农业部年鉴统计，2017年我国葡萄栽培面积87万 hm2，居世界第2位；葡萄总产量1308万 t，居世界第一位，已成为名副其实的葡萄生产大国[1]。

铜是植物生长必需的微量元素[2-3]，在植物的生长发育过程中起着重要作用。铜是Cu/Zn-SOD酶、多酚氧化酶的组成部分，参与呼吸代谢、光合作用等生理过程。一定量的铜促进植物生长发育[4]，但是当铜含量过高，则会对植物发生毒害作用[5]。同时也可通过食物进入人体，危害人类的身体健康。

随着工农业的快速发展，土壤已出现不同程度的重金属污染[6]，我国土壤铜含量为3～300 mg/kg。由于含铜杀菌剂（波尔多液等）的频繁使用，果园土壤中铜污染严重[7-8]。葡萄是使用铜农药较多的果树，常常发生铜毒害[9]。通过对山东省部分长期施用波尔多液的葡萄园土壤调查显示，其含铜量为252.52～487.62 mg/kg[10]。目前，人们尚未揭示葡萄高抗铜胁迫的机理，因此开展葡萄对铜的响应基础研究，为认识葡萄抗铜的分子机制提供重要的理论依据。基于上述认识，本文以葡萄扦插苗为材料，研究不同浓度Cu2+对葡萄根系抗氧化系统的影响，以期为葡萄抗铜的分子机理和铜制剂在葡萄上的合理利用提供重要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

为当年生‘玫瑰香’‘泽香’葡萄扦插苗，枝条长势正常，管理水平良好。首先于2012年12月份剪取两品种一年生长势好的成熟枝条，埋土越冬；然后于来年3月份取出进行沙池扦插（山东农业大学园艺试验站和果树栽培生理实验室）。待扦插苗长至6～10个主根系，选取长势一致、有足量白根的葡萄扦插苗进行试验处理。

1.2 试验方法

首先将材料进行饥饿处理（去离子水中过渡培养10 h），然后进行不同浓度铜处理：1/2 Hoagland营养液为对照（CK），设4个铜离子浓度，A：1/2 Hoagland+0.5 mmol/L CuSO4·5H2O；B：1/2 Hoagland+1.0 mmol/L CuSO4·5H2O；C：1/2 Hoagland+1.5 mmol/L CuSO4·5H2O；D：1/2 Hoagland+2.0 mmol/L CuSO4·5H2O。

每个处理4株，设置3个重复。处理24 h后，选取长势一致的扦插苗的根系（从根部剪取），样品放入液氮速冻，于-70 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3 测定项目

超氧化物歧化酶（S O D）活性采用氮蓝四唑（NBT）显色法测定[13]，过氧化物酶（POD）活性用愈创木酚比色法测定[14]，过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用紫外吸收法[15]。

根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定，用四氮唑的还原强度（μg/g·h）表示根系活力[16]；相对电导率的测定采用浸泡法[17]；丙二醛（MDA）含量采用王爱国等[18]的方法。

1.4 数据分析

采用Office 2010软件对数据进行绘图，并用DPS 7.5软件进行数据统计分析，采用Duncan's新复方极差法进行不同处理间差异显著性分析（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 铜处理对葡萄根系活性的影响

根系是直接受重金属毒害的器官。根系活力直接反应根系的代谢强度。从表1看出，Cu2+对葡萄根系活力有抑制作用，二者呈显著负相关。随着Cu2+浓度的增加，根系活力下降趋势增加。Cu2+浓度为0.5 mmol/L时，根系活力下降了25.73%，而浓度为1.5 mmol/L时，根系活力下降了40.93%，十分明显。而1.5 mmol/L和2 mmol/L的Cu2+浓度处理对根系活力的影响差异不显著，说明随着处理浓度的继续升高，根系活力响应不敏感。

表1 不同浓度铜处理对葡萄根系活性的影响Table 1 Effects of copper on grape roots activity

植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常代谢起着重要作用。逆境胁迫强度与膜透性增大的程度有关。如表1所示，本试验设置的Cu2+浓度下，膜功能受损或结构破坏而通透性增大，电解质外渗加剧，电导率的增加也越大。Cu2+浓度为2 mmol/L时，两品种的根系相对电导率最大，高达对照的3倍，此时根系细胞质膜受损伤的程度已经很大。

根系活力下降，细胞膜遭受损伤严重，根系的电导率升高，膜脂过氧化加重，从而使MDA含量增加。表1显示，增加Cu2+浓度将明显提高葡萄根系中MDA的含量。特别是在Cu2+浓度为1.5 mmol/L时，MDA含量显著高于低浓度Cu2+处理，分别为对照的1.6倍、1.8倍。

2.2 铜处理对葡萄根系抗氧化物酶活性的影响

SOD、POD、CAT是植物体活性氧清除系统，广泛分布于植物各组织器官，能有效清除自由基和过氧化物，以避免自由基积累对生物膜造成破坏。如表2所示，在1.5 mmol/L Cu2+浓度下，葡萄根系SOD酶活性达到最大，与对照差异显著，比对照增加近1倍。在2 mmol/L Cu2+浓度下，SOD活性下降，与对照无显著差异。在1.0 mmol/L Cu2+浓度下POD酶活性达最大，两品种分别为对照的5.9倍和4.7倍，与对照差异显著；在1.5 mmol/L、2 mmol/L的Cu2+浓度下，POD活性下降，仍与对照差异显著。在0～2 mmol/L铜浓度下CAT活性也呈先升高后降低的趋势。在1.0 mmol/L的Cu2+浓度下，CAT活性达最大，与对照差异显著，分别为对照的3.2倍、4.2倍。在1.5 mmol/L、2 mmol/L的Cu2+浓度下，‘玫瑰香’葡萄根系CAT活性仍显著高于对照，而‘泽香’葡萄根系CAT活性与对照无显著差异。在1.0～1.5 mmol/L的Cu2+浓度处理下，SOD、POD、CAT活性变化明显。

表2 不同浓度铜处理对葡萄根系抗氧化物酶活性的影响Table 2 Effects of copper on SOD, POD, CAT characteristics in grape roots

表3 不同浓度铜处理对葡萄根系活性氧的影响Table 3 Effects of copper on O·, H2O2 contents in grape roots

表3 不同浓度铜处理对葡萄根系活性氧的影响Table 3 Effects of copper on O·, H2O2 contents in grape roots

处理Treatment(μmol/g FW)玫瑰香 Muscat Hamburg 泽香 Zexiang O2-·/(μmol/min·g FW)H2O2/O2H2O2/(μmol/g FW)-·/(μmol/min·g FW)CK 527.41 d 38.03 d 509.25 c 27.99 d A 693.28 c 43.47 c 585.71 c 38.87 c B 1303.69 a 59.33 a 1399.02 a 51.04 a C 1078.55 b 48.69 b 932.44 b 49.23 ab D 629.17 c 46.23 c 597.47 c 47.19 b

2.3 铜胁迫对葡萄根系活性氧（ROS）的影响

活性氧是植物体在胁迫条件下的信号转导因子。如表3所示，根系在Cu2+胁迫下产生和H2O2，对根系造成伤害。在设置的4个Cu2+浓度处理下，葡萄根系和H2O2含量呈“先升后降”的趋势。在1.0 mmol/L的Cu2+浓度下，和H2O2含量最高，与对照有显著差异，分别为对照的2.5倍、1.6倍。在1.5 mmol/L、2 mmol/L的Cu2+浓度下，根系产生的·和H2O2呈下降趋势，但仍高于对照。

3 讨论

正常情况下，植物体内活性氧的产生与清除处于动态平衡，但是当植物遭受外界胁迫时，活性氧平衡被打破，会产生活性氧的积累和爆发[19]。本研究显示，在较低铜浓度（0.5～1 mmol/L）胁迫时，葡萄根系产生速率、H2O2含量显著升高，对应浓度下的POD、SOD和CAT活性也随铜浓度的增大而大幅度升高，表明铜处理启动了葡萄根系中的抗氧化酶系统。SOD作为植物体内清除活性氧的关键酶，首先将歧化成H2O2和O2，而CAT和POD则进一步将H2O2直接分解为H2O和O2，三者共同组成一个有效的活性氧清除系统，从而减少H2O2和O2的积累[20-21]。但较高铜浓度（1.5～2 mmol/L）胁迫下，抗氧化物酶活性急剧下降，表明抗氧化酶的保护作用是有限的，超过一定的阈值，抗氧化酶本身也会受到伤害。我们还注意到，‘玫瑰香’‘泽香’葡萄对铜胁迫的反应呈现了基本一致的规律，但3种抗氧化酶对铜胁迫敏感性是有差异的，其中SOD最不敏感，CAT最为敏感，在较高铜浓度（1.5～2 mmol/L）下，CAT活性低于或与对照持平，表明已基本失去保护作用。

MDA含量变化反映膜脂过氧化程度，细胞膜脂发生过氧化会导致细胞膜结构和功能的破坏[21]，铜胁迫处理24 h后，两品种根系MDA含量均显著升高，同时伴随着相对电导率的升高，表明两个品种根系细胞膜结构和功能的完整性均受到伤害，增加了膜透性，造成电解质外渗。而较高铜浓度（1.5～2 mmol/L）胁迫导致抗氧化物酶活性急剧下降，保护作用降低，膜脂过氧化程度和膜的透性进一步提高，大量外渗的电解质通过渗透胁迫加剧伤害，两者的升高与根系活力的急剧下降显示了一致的结果，表明铜胁迫随浓度提高确实加剧了葡萄根系的伤害。

值得注意的是，尽管‘玫瑰香’‘泽香’对铜胁迫的生理反应呈现了基本一致的规律，但两个品种3种抗氧化酶的活性、MDA含量对铜胁迫的敏感性是有差异的，在0～2 mmol/L范围内，‘泽香’的抗氧化酶的活性升高幅度和下降幅度更大，MDA含量升高幅度更大，表明‘泽香’抗氧化酶的活性和MDA含量对铜胁迫的响应比‘玫瑰香’更敏感，其耐铜性的强弱还有待于进一步的研究。

4 结论

本试验用Cu2+对当年生的葡萄扦插苗进行处理，并分析了不同浓度的Cu2+处理对葡萄根系活性、抗氧化物酶活性和活性氧含量的影响。试验结果表明：本试验设置的Cu2+浓度下均使根系活力下降，细胞膜遭受损伤严重，根系的电导率升高，膜脂过氧化加重，从而使丙二醛含量增加；在1.0 mmol/L的和1.5 mmol/L Cu2+浓度处理下，SOD、POD、CAT酶活性达到最高；在1.0 mmol/L的Cu2+浓度处理下，和H2O2含量最高。