新型IKKβ激酶抑制剂的体外抗胃癌活性

鲍苗，黄崇贤，胡俊，朱露，卫涛，陈肖鸣

（1.温州医科大学附属第一医院 小儿外科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学 药学院，浙江 温州325035）

我国是胃癌发病大国[1]。目前胃癌的主要治疗手段为手术切除及化学药物治疗，常用的化疗药物为5-氟尿嘧啶、顺铂、多西紫杉醇等细胞毒类药 物[2-4]。这类药物最大的缺陷是不良反应严重，且易耐药。靶向药物因其高效低毒的特点，成为近年抗肿瘤药物的研究热点。然而胃癌的靶向药物研究相对滞后，仅有针对HER2和VEGFR的药物被批准用于临床治疗。

IκB激酶β（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β，IKKβ）是细胞中核转录因子NFκB重要的调节酶，参与多种细胞生物途径。研究表明，其高表达与胃癌等多种肿瘤的发生密切相关，抑制肿瘤细胞内的IKKβ可达到抗肿瘤效果[5-8]。小分子IKKβ激酶抑制剂是目前研究热点，然而由于活性不强等原因，其抑制剂研究进展缓慢[8]。因此研发高效的IKKβ抑制剂具有非常重要的意义。

EF24为一种对多种肿瘤具有良好抗肿瘤活性的IKKβ抑制剂（IC50=72 μmol/L）[9]，但其激酶抑制活性有待提高。我们对本实验室设计合成的EF24类似物进行了筛选，获得了一个激酶抑制活性更好的类似物H18（见图1），并研究了其体外抗胃癌活性。

图1 H18的结构及发现

1 材料和方法

1.1 材料 人胃癌细胞BGC-823购于中国科学院上海细胞典藏库，RMPI-1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25%含EDTA胰酶购于美国Gibco公司，PBS缓冲液、双抗购于美国Hyclone公司，MTT粉末购于北京索莱宝生物科技有限公司，抗人p-IKKα/β、IKKβ、IκBα、β-Actin抗体、抗兔二抗购于美国CST公司，TNF-α（T0157）和BMS345541（B9935）购于美国Sigma-Aldrich公司，CO2培养箱购于美国Thermo公司，DAPI染色液和结晶紫染色液购于上海碧云天生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白分子对接：下载人IKKβ蛋白晶体结构（PDB code：4KIK），与H18进行对接模拟。通过AutoDock模拟蛋白与分子对接形式，并进行可视化。

1.2.2 MTT实验：取对数生长期细胞，以3 000个每孔的密度铺在96孔板中，置于培养箱中过夜贴壁。第2天取出加药。H18用DMSO溶解配成0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50 μmol/L共8个浓 度，每个浓度设置3个复孔，每孔加药1 μL。同时设 置空白孔和DMSO孔。药物孵育72 h后，每孔加入MTT 孵育4 h，弃去培养液，用150 μL DMSO溶解紫色晶体，摇床上振荡10 min充分溶解，在酶标仪490 nm处测量吸光度。重复3次获得数据，计算IC50。

1.2.3 集落克隆实验：细胞每孔1 000个铺6孔板，过夜贴壁后换液加药。H18分别为5、10、20 μmol/L， 并用BMS345541作阳性对照。药物孵育7 h后换成完全培养基继续培养1周。用4%多聚甲醛固定15 min 后进行结晶紫染色，然后拍照。

1.2.4 DAPI染色：细胞每孔20万铺板，过夜贴壁后换液加药。H18分别为5、10、20 μmol/L，并用BMS345541作阳性对照。药物孵育时间48 h，然后用4%多聚甲醛固定后，避光加入DAPI染色液染色，在荧光拍照显微镜紫外光下拍照。

1.2.5 Western blot实验：细胞30 万每孔铺板，先加H18分别为5、10、20 μmol/L，并用BMS345541作阳性对照，孵育2 h后，然后除空白孔以外，每孔加TNF-α，终浓度为1.5 ng/mL。TNF-α刺激10 min后，马上冰上收蛋白。用考马斯亮蓝法定量配平后，加入loading buffer将蛋白样品煮沸变性。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，再进行湿法转膜。 4 ℃过夜孵育一抗后，室温孵育二抗1 h，然后曝光。

1.3 统计学处理方法 采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，运用独立样本t检验进行2组比较，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H18与IKKβ的分子对接 通过分子对接初步探讨化合物H18与IKKβ激酶的相互作用模式，对接结果见图2，H18环戊酮上的羰基氧原子与残基Leu307形成氢键相互作用；同时，H18能与IKKβ变构位点中的Leu123、Leu307、Leu311、Ile371和Leu376等氨基酸残基形成疏水作用。氢键作用与疏水作用的叠加效果使得化合物与激酶紧密结合。

2.2 H18抑制BGC-823生长 利用MTT法对H18的抗胃癌活性进行检测，结果发现H18以剂量依赖的方式抑制BGC-823细胞的生长，半数抑制浓度为（1.7± 0.3）μmol/L（见图3）。

图2 H18与IKKβ的分子对接

图3 H18作用72 h的浓度-生存曲线

2.3 H18对BGC-823增殖和凋亡的影响 集落克隆实验结果显示，H18孵育7 h能明显抑制BGC-823的克隆形成能力（见图4A）。DAPI染色结果显示，H18处理48 h，BGC-823细胞无明显凋亡改变，而相同条件下阳性对照BMS345541的刺激已造成部分细胞发生凋亡（图4B白色箭头所示）。以上结果说明，H18主要通过抑制细胞增殖分裂从而产生抗胃癌细胞的作用。

2.4 H18对IKK-NF-κB信号通路的影响 Western blot实验结果显示，对比空白组，TNF-α 10 min刺激后成功诱导了IKK-NF-κB信号通路的激活；与TNF-α组相比，提前2 h预孵的药物显著抑制了TNF-α诱导的IKKβ的激活。尽管H18的抑制活性不如同等条件下的BMS345541，但也表现出了显著的抑制活性（P＜0.05）；同时，H18可以剂量依赖性地抑制下游IκBα的降解，与BMS345541保持一致的效果（见图5）。从另一方面也提示NF-κB复合物另一亚单位，P65解离后调节生物学进程可能受到了部分抑制。这说明，IKKβ抑制剂H18对IKK-NF-κB的抑制可能促成了其体外抗胃癌活性。

图4 H18对BGC-823的增殖和凋亡的影响

3 讨论

目前胃癌的靶向治疗研究虽然很多[10]，但是临床上已批准使用的仅有HER2抑制剂曲妥珠单抗、VEGFR抑制剂雷莫芦单抗和阿帕替尼[11]。此外，报道的胃癌潜在靶点也很多，常见的如：PTEN[12]、mTOR[13]以及其他多种非编码RNA[14-16]。

已有多项研究发现，抑制IKK可起到多种抗肿瘤作用：经典的IKK抑制剂BMS345541可在前列腺癌中抑制上皮间质转化，并促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制前列腺癌转移[17]。ANTONIA等[18]发现，在LKB1缺陷的肿瘤患者中，IKK抑制剂与苯乙双胍可产生联合抗肿瘤的作用。VREKA等[19]研究发现，高表达的IKKα可与KRAS共同诱导肺癌的发生，抑制IKKα可起到良好的抗肺癌活性。本研究发现，在胃癌细胞中抑制IKKβ的磷酸化激活，可起到体外抗胃癌的活性，这与先前的研究结果一致。

图5 IKKβ抑制剂H18对IKK-NF-κB的抑制作用

EF24作为一个经典的姜黄素类似物，研究认为其具有抑制NF-κB信号通路的作用[20]。以EF24为先导化合物，设计合成EF24类似物可提高其对NF-κB的抑制活性：通过优化N取代获得的化合物13 d，与EF24相比毒性下降，且对NF-κB的抑制活性得到提升[21]；以EF24和F35为共同先导化合物设计合成的5B，可通过激活JUK及抑制NF-κB信号通路产生抗肺癌作用，并在体外增敏顺铂及5-氟尿嘧啶的化疗效果[22]；不对称EF24类似物化合物81，通过抑制NF-κB信号通路产生抗肺癌作用[23]。本课题以EF24为先导化合物，将其结构进行改造，得到了新型化合物H18，使其对IKKβ的IC50从72 μmol/L降至 4.5 μmol/L，大大提高了其抑制活性，同时证明，新获得的化合物H18通过抑制IKK-NF-κB信号通路产生体外抗胃癌效果。

综上所述，我们的研究初步证明了IKKβ抑制剂H18的体外抗胃癌活性及机制，为IKKβ抑制剂的开发提供了新结构，为胃癌靶向治疗提供了新的策略。