高、低硝态氮营养条件下烟草根系基因表达谱及代谢途径的差异分析

张玉宁，史宏志，王 景，周 炎，杨惠娟

河南农业大学烟草学院 国家烟草栽培生理生化基地，郑州市金水区农业路63号 450002

氮素是植物生长过程中所必需的大量元素之一，对烟草的生长以及烟叶品质形成有重要作用［1-3］。根系是植物吸收水分和养分的主要器官，氮素营养对根系生长有较大影响［4］。硝态氮不仅是植物生长所需的主要氮源，作为信号分子对植物生长发育也有重要影响［5］。硝酸根信号的传导是通过植物根系，不同浓度的硝酸根信号会引起根系基因表达的变化，研究不同氮营养条件下烟草根系基因表达的差异能够阐明烟草根系对硝态氮信号响应的相关分子机制。有研究表明，硝酸根作为信号分子对植物磷酸戊糖氧化、糖酵解、氨基酸代谢等多种重要的生理途径有重要作用，对相关基因也有重要的诱导和调控作用［5-7］。硝酸根信号对植物体其他生长发育相关代谢途径的基因也有重要调节作用，其中硝酸还原酶基因和亚硝酸还原酶基因是典型的受硝酸根调节基因。已有研究表明，一些参与硝酸根信号响应调控途径的基因或转录因子，如拟南芥中的ANR1，在NO3-充足条件下可以促进侧根的生长［8-10］。但烤烟根系对外界硝酸根信号的分子响应机制尚不明确，尤其是不同浓度硝酸根营养条件下烤烟根系的差异表达基因亟待研究。为此，利用转录组测序技术对烟草根系响应不同浓度硝态氮营养的差异表达基因进行分析，旨在为明确植物硝酸根信号转导过程以及烤烟氮素营养的代谢机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

以烤烟品种K326 为试验材料，采用漂浮育苗技术培育烟苗，烟苗长至3～4 片真叶时移栽，取生长状况一致的健壮烟苗移植于水槽中，放置于光照培养架上，用MS 液体培养基培养。试验在温湿度可控制的温室中进行，培养条件为14 h 光照，10 h 黑暗，温度28 ℃左右，相对湿度在65%～75%，每3 d更换1 次营养液，待烟苗长至6～8 片叶时进行处理。设置高浓度氮营养处理组（硝酸根浓度为5.0 mmol/L）、低浓度氮营养处理组（硝酸根浓度为0.1 mmol/L）及正常氮营养处理组，用氯化钾调节钾营养浓度一致。取正常氮营养浓度培养的烟草根系样品（CK，0 h），高氮营养处理后分别于6、12 和 24 h 取 3～5 株烟苗根系样品（H.6、H.12 和H.24），低氮营养处理后分别于 6、12 和 24 h 取 3～5 株烟苗根系样品（L.6、L.12 和L.24），迅速清洗后混匀放入液氮中速冻，并保存于-80 ℃冰箱中。设置3 次生物学重复。

1.2 RNA提取与建库测序

将样品送至武汉菲莎基因信息有限公司进行转录组测序。用CTAB 法进行样品总RNA 的提取，选择质量适宜的总RNA 作为mRNA 建库起始样品；用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，接着配制mRNA 片段化反应体系将其片段化至目标长度范围；以打断后的mRNA 为模板，用六碱基随机引物合成第一链cDNA，再配制第二链合成反应体系合成第二链cDNA；纯化后进行末端修复、加A 尾并连接测序接头；进行片段大小选择，然后进行PCR 扩增。扩增体系50 μL，包括：20 μ L cDNA，3 μ L USER 酶，25 μ L High-Fidely PCR 预混液，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物。扩增条件：98 ℃预变性 30 s；98 ℃变性 10 s、65 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 12 个循环；72 ℃ 5min，4 ℃保存。将PCR 产物进行纯化得到最终文库，构建的文库质检合格后进行测序。测序得到的原始数据经碱基识别（Base calling）分析转化为原始的未经过滤的测序序列（Reads），然后对原始的未经过滤测序序列进行质控（QC）过滤，再对过滤后测序数据进行质量评估，以确定测序数据是否适用于后续的生物信息学分析。

1.3 差异表达基因的筛选

基因差异表达分析的输入数据为基因表达水平分析中得到的数据，用R 语言包edgeR 进行差异分 析［11］，筛 选 阈 值 为 FDR ＜0.05，log2FC ＞1 或log2FC＜-1。

1.4 生物信息学分析

通过Cluster 软件对基因表达模式进行聚类分析，从整体上直观反映多个样本中相同基因的表达模式。基于聚类分析结果，根据基因表达情况将差异表达基因进一步划分为Sub-cluster 亚群，并进行代谢通路（Pathway）富集分析。KEGG 是有关代谢通路的主要公共数据库，代谢通路显著性富集分析以KEGG Pathway 为单位，应用超几何检验，找出差异基因相对于所有注释基因显著富集的代谢通路。

2 结果与分析

2.1 测序数据的质量控制与评估

利用高通量测序技术，对高、低两种硝酸根浓度处理后不同时间点获得的21 个样本进行转录组测序，测序数据质量评估结果见表1。经筛选过滤后，共得到669 810 979 条测序序列（Clean reads），碱基错误率均小于0.03%，Q30 均大于 85.00%。说明本试验中的转录组测序数据质量好、准确度高，能够满足后续数据分析的需要。

表1 RNA-seq 数据统计Tab.1 Overview of RNA-seq data

2.2 高、低氮浓度营养条件下烟草根部基因表达的聚类分析

通过Cluster 软件对基因表达进行聚类分析结果见图1。从图中可以看出，与对照组相比，部分基因的表达随时间的推移无明显变化，包括持续高表达基因（红色区域）、持续低表达基因（蓝色基因）和差异表达基因。对差异表达基因进一步进行亚群分析（图2）表明，高氮营养条件下差异表达基因分为 4 个 Sub-cluster 亚群。Sub-cluster 1 亚群基因表达量呈现先下降后上升的趋势，在处理6 h和12 h 时表达量持续降低，处理24 h 时表达量略微升高。Sub-cluster 2 和Sub-cluster 4 亚群基因在处理后6 h 时表达量显著上升，处理12 h 时表达量有所降低，处理24 h 时表达量又有所上升。Sub-cluster 3 亚群基因与对照组相比表达量缓慢上升。

低氮营养条件下差异表达基因分为3 个Sub-cluster 亚群。Sub-cluster 5 亚群基因在处理0～24 h 时表达量仅有略微变化，个别基因在处理6 h 和12 h 时表达量有所升高但随后又下降，整体呈现略微上升趋势。Sub-cluster 6 亚群基因表达量先急剧下降，之后又上升，在处理12 h 时表达量达到最低，呈现先下降后上升的趋势。Sub-cluster 7亚群基因在处理6 h 时表达量最高，随后逐渐降低，在处理24 h 时表达量略高于处理前水平。

2.3 不同氮水平营养条件下烟草根部差异表达基因亚群的KEGG分析

2.3.1 高氮条件下差异表达基因亚群的KEGG分析

高氮营养条件下差异表达基因的不同亚群KEGG 代谢通路分析结果见表2。其中Sub-cluster 1 亚群中基因主要集中在戊糖和葡萄糖（醛酸转化、玉米素生物合成、烟酸和烟酰胺代谢等代谢通路中。

图1 高、低氮水平营养条件下烟草根部基因表达模式Fig.1 Gene expression profiles of tobacco roots at high and low levels of nitrate nitrogen

图2 高低氮营养水平下烟草根部差异表达基因的亚群分类Fig.2 Sub-clusters of differentially expressed genes in tobacco roots at high and low levels of nitrate nitrogen

表2 高氮水平营养条件下基因显著富集的部分代谢通路条目Tab.2 Partial KEGG pathways of differentially expressed genes at high level of nitrate nitrogen

Sub-cluster 2 与Sub-cluster 4 亚群中基因的表达模式类似，均在处理6 h 时基因表达量显著提高，处理12 h 时有所降低，处理24 h 时表达量又上升。Sub-cluster 2 亚群中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径的丙氨酸乙醛酸转氨酶、天冬酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶基因表达量显著上调，以及牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径的半胱胺双加氧酶、谷氨酸脱羧酶两个基因的表达量也显著上调。生物素代谢途径和脂肪酸生物合成途径的 FabF、FabG、FabZ 和FabI 4 个酶基因，托品烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成途径的腐胺N-甲基转移酶基因表达量上调。另外，多个涉及氨基酸合成途径的关键酶基因表达量也呈显著上调模式，如精氨酸生物合成和脯氨酸代谢途径中的精氨酸酶基因，苯丙氨酸代谢途径中的天冬氨酸转氨酶基因，丙酮酸代谢途径中的丙酮酸激酶基因，赖氨酸生物合成途径中的反-肉桂酸-4-单加氧酶、莽草酸-O-羟基肉桂酰基转移酶、阿魏酰-5-羟基化酶和咖啡酸-3-O-甲基转移酶等基因，以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径中的谷氨酸脱氢酶基因。Sub-cluster 4 亚群中涉及核糖体途径的较多基因表达量上调，苯丙素生物合成、苯丙氨酸代谢、类黄酮生物合成以及二苯乙烯类和姜酚生物合成等途径中的少量基因表达量也上调。

Sub-cluster 3 亚群中基因的表达量呈缓慢上升趋势。嘌呤代谢途径和嘧啶代谢途径中核苷二磷酸激酶等基因表达量均上调；植物激素信号转导，果糖和甘露糖代谢，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等其他代谢途径中基因表达量也均有上调。

2.3.2 低氮条件下差异表达基因亚群的KEGG分析

低氮营养条件下差异表达基因的亚群分析结果（表3）显示：Sub-cluster 6 和Sub-cluster 7 亚群中基因表达量变化显著；Sub-cluster 6 亚群中的基因表达量呈先下降后上升的趋势，在处理12 h 时表达量最低。发生变化的基因为生物素代谢和脂肪酸生物合成途径中的FabF、FabG、FabZ 和FabI 4个酶基因；与组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等合成相关的基因如乙酰鸟氨酸氨基转移酶、莽草酸脱氢酶和酪氨酸转氨酶基因等；嘌呤代谢和嘧啶代谢中的核苷二磷酸激酶、5'-核苷酸酶基因；托品烷、哌啶和吡啶生物碱合成途径中的腐胺N-甲基转移酶、伯胺氧化酶基因等。另外，还包括淀粉和蔗糖代谢途径中的己糖激酶和果糖激酶基因等。

Sub-cluster 7 亚群中的基因表达量呈先上升后下降趋势，在处理后6 h 时表达量最高，随后逐渐降低。其中，核糖体中多个核糖体蛋白基因，苯丙素生物合成中的咖啡酸3-O-甲基转移酶和阿魏酰-5-羟基化酶基因，氨基酸合成途径中的谷氨酸脱氢酶、天冬酰胺合成酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱羧酶基因，以及氮代谢途径中的硝酸还原酶基因等表达量均上调。

表3 低氮水平营养条件下差异基因显著富集的部分代谢通路条目Tab.3 Partial KEGG pathways of differentially expressed genes at low level of nitrate nitrogen

2.3.3 高、低氮营养条件下KEGG 代谢途径的比对分析

表4 表明，在高氮、低氮营养条件下处理6 h时一些基因表达量均显著上调，主要集中在核糖体、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢等9 个代谢途径中。如苯丙素生物合成中的咖啡酸-3-O-甲基转移酶、阿魏酰-5-羟基化酶基因，多种氨基酸合成与代谢途径中的谷氨酸脱氢酶、天冬酰胺合成酶、琥珀酸半醛脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、谷氨酰胺合成酶、丙氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸激酶、脯氨酰4-羟化酶、脯氨酸脱氢酶等多个基因表达量均在处理6 h 时表达量最高。

低氮营养条件处理6 h 时一些基因表达量显著下降，而高氮营养条件下处理6 h 时表达量则显著上升，表达模式截然相反。这些基因主要集中在生物素代谢，托品烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，嘧啶与嘌呤代谢，蔗糖和淀粉代谢，脂肪酸代谢等途径。这表明在低氮营养条件下这些代谢受到一定程度的抑制。

表4 两种氮水平营养条件下差异表达基因显著富集的相同代谢通路条目Tab.4 Same KEGG pathways of differentially expressed genes at high and low levels of nitrate nitrogen

3 讨论

本研究中对高、低氮营养条件下烟草根系的转录组进行分析发现，随着处理时间的延长表达模式相似的基因聚成一类。通过KEGG 代谢途径的生物信息学分析，两种氮营养条件下差异基因主要集中在苯丙素生物合成等途径中。这与前人对谷子［12］、灯盏花［13］低氮胁迫下的转录组分析结果基本一致，说明大量相关调控基因参与碳氮代谢等一些次级代谢途径进而影响烤烟的生长发育。但对高氮胁迫条件下的转录组分析较少，尚需进一步研究。

集中在核糖体、苯丙素生物合成以及多种氨基酸合成与代谢等途径中的差异表达基因的表达量均为处理6 h 时显著升高。咖啡酸3-O-甲基转移酶、阿魏酰-5-羟基化酶基因是木质素生物合成过程的关键基因［14］，而木质素在植物抵御外界胁迫中发挥重要作用［15］。本研究中这两种酶在苯丙素生物合成途径中表达量上调可能与此有关。多种氨基酸合成与代谢途径中的谷氨酸脱氢酶基因表达量上调可能是由于谷氨酸脱氢酶在植物逆境胁迫中体内碳氮代谢调控上发挥重要作用引起的［16-18］。谷氨酸脱羧酶能调节植物体内的碳氮平衡、参与调节植株与逆境胁迫相关的基因表达［19］，本研究中谷氨酸脱羧酶基因表达上调可能也与此有关。天冬酰胺合成酶、谷氨酰胺合成酶等基因表达也上调，这可能与天冬酰胺合成酶在调控氮代谢和氮的库源关系中发挥作用［20］，谷氨酰胺合成酶提高植株耐氮胁迫能力有关［21］。

生物素代谢等途径中的差异表达基因在高氮营养条件下处理6 h 时表达量显著上调，低氮条件下则与之相反；但发生变化的基因相同，说明氮素的不足会抑制烤烟根系生物碱的合成与能量代谢，而氮素过量则起到促进作用。托品烷、哌啶和吡啶生物碱中的腐胺N-甲基转移酶是合成烟碱的关键酶［22-23］，而烟碱对烟叶品质有重要影响［24］。本研究中差异表达基因集中的代谢途径中与碳代谢相关的途径较多，说明氮营养水平的变化对碳代谢影响较大。氨基酸生物合成及代谢途径中的基因也发生变化，说明这些途径的代谢活动在抵抗氮胁迫过程中发挥作用，并参与植物体内氮代谢途径及碳氮平衡的调节［25］。可见，高、低氮营养条件下可能有相同的硝酸根信号转导途径，只是在碳氮代谢等次级代谢及与烟草生长相关途径响应胁迫后机体发生的变化不同。而有关高、低硝态氮营养条件下硝酸信号转导的共同途径以及氮信号途径中起主要调控作用的基因仍需要进一步深入研究。

4 结论

在温室（14 h 光照，10 h 黑暗，温度 28 ℃，相对湿度65%～75%）条件下进行了烤烟品种K326烟苗培育及高浓度硝态氮与低浓度硝态氮营养胁迫处理试验。结果表明：高氮和低氮营养条件下Sub-cluster 亚群中的一些基因表达量先上调之后又下降，这些基因主要涉及苯丙素生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等途径。氨基酸、碳氮代谢途径是响应不同氮营养条件的重要代谢途径，低浓度氮营养可抑制烤烟根部托品烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成，嘧啶和嘌呤代谢，果糖和甘露糖代谢，淀粉和蔗糖代谢等多条途径关键基因的表达，而高浓度氮营养则促进其基因表达。