5种市售枫槭浸膏挥发性成分的HS-SPME-GC/MS分析

蔡莉莉，柴国璧，王 东，罗灿选，张启东，赵志伟*，刘前进，席高磊，郝 辉，孙志涛，陈芝飞*

1.河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州经济技术开发区第三大街8号 450016

2.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

枫槭浸膏是国家标准 GB 2760—2014［1］允许使用的一种食品用天然香料，也是一种重要的烟草添加剂。枫槭浸膏具有强烈的焦糖香气，其在卷烟中应用时不仅可赋予卷烟焦甜香、烘烤香等香韵，而且可以改善余味，减少杂气和刺激性。然而，目前国内外研究主要集中在枫糖化学成分分析，未见枫槭浸膏化学成分的相关研究报道［2-5］。因此，研究枫槭浸膏的成分组成特征对于指导其在卷烟中的应用具有重要意义。顶空固相微萃取（Headspace Solid-Phase Microextraction，HS-SPME）是将吸附涂层（萃取纤维头）暴露在样品上方富集待测组分的方法，是固相微萃取的一种萃取方式。与水蒸气蒸馏、同时蒸馏萃取、溶剂萃取等方法相比，HS-SPME 操作简单、灵敏度高、样品用量少，目标成分的采集、萃取、浓缩操作可一步完成，且在样品制备过程无需有机溶剂。该方法可有效消减样品基质干扰，并且能与GC/MS 方法直接联用。目前，HS-SPME 已广泛应用于不同样品中挥发性成分的分析研究［6-10］。因此，本研究中通过对SPME 萃取纤维头和萃取条件进行考察，建立枫槭浸膏挥发性成分的HS-SPME-GC/MS 方法，并对不同枫槭浸膏挥发性成分进行分析，比较其挥发性成分差异，旨在阐明枫槭浸膏香气成分的化学组成，为枫槭浸膏在烟草工业领域中的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

枫槭浸膏DP、XH、W、GZ、AP 均为市售产品，由河南中烟工业有限责任公司提供。氯化钠（AR，国药集团化学试剂有限公司）；C7～C40正构烷烃混合标样（1 mg/L，美国Supelco 公司）；二氯甲烷（色谱纯）及丙酸苏合香酯标准品（≥98%，美国Sigma-Aldrich 公司）。

7890A/5977C 型气相色谱/质谱联用仪（美国Agilent 公司）；SPME 手柄、SPME 萃取纤维头（具体参数见表1）及SPME 进样口导向器（美国Supelco 公司）；40 mL 带橡胶垫螺纹顶空进样玻璃瓶（美国 CNW 公司）；CP2245 电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius 公司）；HH-S1 型恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 枫槭浸膏的嗅香评价

参考 YC/T 497—2014［11］中的嗅香评价方法，结合烟用香料实际情况，选取16 种常用香韵（树脂香、干草香、清香、果香、辛香、木香、青滋香、花香、药草香、豆香、可可香、奶香、膏香、烘焙香、焦香和甜香）对5 种枫槭浸膏样品进行嗅香评价，量化分值为0～5 分，记分单位为0.5 分。在剔除离群值后，通过计算平均值确定样品各个香韵的分值。嗅香评价的评委均具备国家烟草质量监督检验中心颁发的卷烟感官评吸资质，评委数量为7 人。

表1 SPME 萃取纤维头及活化条件Tab.1 Extraction fibers and activation conditions of SPME

1.2.2 枫槭浸膏的HS-SPME-GC/MS 分析

称取约0.007 0 g（精确至0.000 1 g）枫槭浸膏置于顶空瓶中，加入10 μL 2.48 mg/L 丙酸苏合香酯（内标）溶液和0.5 mL 5 mol/L 氯化钠水溶液，摇匀；置于60 ℃水浴中，插入SPME 萃取纤维头（使用前需活化，活化条件见表1）吸附50 min；将萃取纤维头在GC/MS 进样口（温度250 ℃）解吸附4 min，然后分别采用 HP-INNOWAX 和 DB-5MS 两种不同极性的色谱柱进行GC/MS 分析。GC/MS分析条件为：

色谱柱1：HP-INNOWAX 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：He；流量：1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样方式：手动模式，不分流进样；溶剂延迟：4 min；升温程序：初始温度40 ℃，保持 4 min，以 2 ℃/min 升温至 230 ℃，保持 10 min；离子源温度：230 ℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；传输线温度：250 ℃；质量扫描范围：50～500 amu。

色谱柱2：DB-5MS 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气：He；流量：1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样方式：手动模式，不分流进样；溶剂延迟：4 min；升温程序：初始温度40 ℃，保持4 min，以 2 ℃/min 升温至 230 ℃，保持 10 min；离子源温度：230 ℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；传输线温度：260 ℃；质量扫描范围：50～500 amu。

1.2.3 枫槭浸膏挥发性成分的定性分析

借助NIST 和Wiley 库标准质谱图比对（匹配度≥85%）、保留指数（Retention time index，RI）比对进行化合物定性分析。其中，RI 根据改进的Kovats 法计算得到，具体操作为：将10 μL 1 mg/L C7～C40正构烷烃混合标样加入样品中，混合均匀后进行HS-SPME-GC/MS 分析，依据化合物和正构烷烃的色谱保留时间，采用公式（1）进行计算RI。

式中：tR—目标组分流出峰的保留时间，min；tn、tn+1—碳原子数为n 和n+1 的正烷烃流出峰的保留时间，min。tn＜tR＜tn+1。

1.2.4 数据处理

采用SPSS18.0 和PAST3 软件分别进行单因素方差分析(One-way AVONA) 和主成分分析(Principle Component Analysis，PCA)。

2 结果与讨论

2.1 嗅香评价结果分析

为了明确5 种枫槭浸膏样品的感官特征，采用香气轮廓分析法对5 种样品的嗅香进行了评价分析，结果见图1。从图1 可以看出，5 种样品的主香韵较为一致，同时在其他香韵上又存在一定差异。5 种样品的焦香、甜香和烘焙香均较为突出；样品DP、XH 和W 的感官特征较为类似，除3 种主要香韵外可可香和奶香也相对强烈；样品AP 则表现出较强烈的膏香；样品GZ 的辛香和果香较其他4 种样品更为明显。

图1 5 种枫槭浸膏样品的嗅香评价结果Fig.1 Olfactory sensory evaluation of 5 maple concrete samples

2.2 HS-SPME条件的优化

2.2.1 萃取纤维头的选择

在萃取温度50 ℃、萃取时间30 min、解吸温度250 ℃、解吸时间4 min 条件下，对 100 μm PDMS、75 μm Carboxen/PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm PA 和 60 μm PEG等6 种极性不同的SPME 萃取纤维头（表1）进行考察，分析其对枫槭浸膏挥发性成分的萃取效率。6种SPME 萃取纤维头的GC/MS 总离子流图和不同种类化合物色谱图峰面积分别见图2 和图3。

图2 不同SPME 萃取纤维头GC/MS 总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms by GC/MS with different SPME fibers

图3 不同种类化合物色谱图的峰面积Fig.3 Chromatographic peek areas of different types of compounds

由图3 可知，采用6 种不同SPME 萃取纤维头检出的挥发性成分在种类和数量上有较大差异。其中，采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头检出的挥发性成分种类和数量较多，且挥发性成分色谱峰总面积最大，说明其对碳氢化合物、醛酮类、醇醚类、酯类（内酯）、酸类以及杂环类均具有较好萃取效果。因此，选择50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头。

2.2.2 萃取温度的确定

采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纤维头，固定萃取时间30 min、解吸温度250 ℃、解吸时间4 min，考察不同萃取温度(30、40、50、60 和 70 ℃)对萃取效率的影响，结果见图4。由图4 可知，当温度从30 ℃升至60 ℃时，萃取效率呈上升趋势，60 ℃时萃取成分的总峰面积最大，当温度高于60 ℃时，各类化合物峰面积增加不明显。因此，确定萃取温度为60 ℃。

图4 萃取温度对萃取效率的影响Fig.4 Influence of extraction temperature on extraction efficiency

2.2.3 萃取时间的确定

采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纤维头，固定萃取温度60 ℃、解吸温度250 ℃、解吸时间4 min，考察不同萃取时间(20、30、40、50、60 和 70 min)对萃取效率影响，结果见图5。由图5 可知，随着萃取时间的延长，萃取的各类化合物总量逐渐增加，50 min 后趋于稳定，表明样品基质、顶空和SPME 之间已经达到动态平衡。因此，确定萃取时间为50 min。

图5 萃取时间对萃取效率的影响Fig.5 Influence of extraction time on extraction efficiency

2.2.4 解吸时间的确定

采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纤维头，固定萃取温度60 ℃、萃取时间50 min、解吸温度250 ℃，考察不同解吸时间(2、3、4、5 和6 min)对解吸效果的影响，结果见图6。由图6 可知，随着解吸时间的延长，解吸效率呈增大趋势；当解吸时间达到4 min 时，萃取的化合物已基本实现热脱附。因此，确定解吸时间为4 min。

图6 解吸时间对萃取效率的影响Fig.6 Influence of desorption time on extraction efficiency

2.3 枫槭浸膏挥发性成分的定性分析

为了提高定性结果的准确性，首先通过HP-INNOWAX 色谱柱对样品进行分析，结合标准质谱图比对和保留指数初步定性，再采用DB-5MS色谱柱进行分析，利用该色谱柱上的保留指数对定性结果进一步验证。DP、XH、W、GZ、AP 等5 种市售枫槭浸膏样品的定性分析结果见图7 和表2。

由表2 可知：①从5 种枫槭浸膏中共鉴定出104 种挥发性成分，主要为碳氢化合物、醛酮类、酯类（含内酯）、醇醚类、有机酸类、杂环类和酚类物质；不同市售枫槭浸膏的挥发性成分差异较大，其中，浸膏 DP 为 41 种，XH 为 48 种，W 为 42 种，GZ为 79 种，AP 为 36 种。②104 种挥发性成分中，文献报道具有香气特征的挥发性成分为79 种；16 种挥发性成分（柏木烯、1-苯基-1-戊酮、十五酸乙酯、棕榈酸甲酯、对乙基苯乙酮、肉豆蔻醚、9-十六碳烯酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚、洋芹脑、十七烷酸乙酯、丁烯基苯酞、藁本内酯、4-甲基二苯甲酮、亚麻酸乙酯、3-羟基苯乙酮和间羟基苯甲醛）的香气特征尽管没有文献记载，但其结构类似的化合物均表现出特定的香气，如4-甲基二苯甲酮和二苯甲酮均呈现淡弱带青涩的甜香、似玫瑰香叶香气［12-13］，由此可推测这16 种挥发性成分也具有类似的香气特征。因此，通过HS-SPME-GC/MS 检测到95 种香气成分，占挥发性成分总数91.3%。③5种枫槭浸膏的共有香气成分为11 种（5-甲基糠醛、麦芽酚、2-乙酰基呋喃、2，6-二甲基吡嗪、苯甲醛、愈创木酚、丁酸苯甲酯、对乙基苯乙酮、苯甲酸、香兰素和棕榈酸），5 种枫槭浸膏中这11 种香气成分的峰面积之和占其挥发性成分总峰面积的百分比分别为43.4%、19.4%、36.0%、12.3%和30.4%；这11 种香气成分多表现出焦香和甜香的特征，在赋予枫槭浸膏特征香气方面起着重要作用。④虽然枫槭浸膏具有“能使人联想到甲基环戊烯醇酮的香气特征”［15］，但仅在枫槭浸膏 AP 中检测到甲基环戊烯醇酮，而具有类似香气特征的麦芽酚、葫芦巴内酯、5-甲基糠醛、2-乙酰基呋喃、5-羟甲基糠醛等成分则在不同样品中均有出现；同时，具有香荚兰豆特征甜香的香兰素均为5 种枫槭浸膏主要成分，其峰面积占比分别为25.7%、14.1%、28.6%、9.6%和24.2%。

2.4 枫槭浸膏挥发性成分的差异分析

2.4.1 One-way ANOVA 分析

采用One-way ANOVA 方法对5 种枫槭浸膏化学分析的结果进行分析，考察不同枫槭浸膏挥发性成分差异显著性，结果见图8。

图7 5 个枫槭浸膏样品的TIC 图Fig.7 Total ion chromatograms of 5 maple concrete samples

表2 5 种枫槭浸膏的挥发性成分①Tab.2 Volatile components in 5 maple concrete samples

表2（续）

表2（续）

表2（续）

图8 不同枫槭浸膏挥发性成分种类差异(n=5)Fig.8 Difference of types of volatile components in different maple concrete samples (n=5)

由图8 可知，整体上5 种市售枫槭浸膏挥发性成分存在显著差异。对于醛酮类、酸类、杂环类挥发性成分，5 种枫槭浸膏均存在显著差异；DP 和W的碳氢化合物、DP、W 和 AP 的醇醚类、W 和 AP 的酯类（含内酯）、DP 和XH 的酚类不存在显著差异，其余均存在显著差异。另外，枫槭浸膏DP 以醛酮类、酯类（含内酯）、杂环类和酸类化合物为主，且醛酮类和酯类（含内酯）相对含量较高；枫槭浸膏XH 以酯类、醛酮类和酸类化合物为主，且酯类物质明显高于其他浸膏；枫槭浸膏W 和AP 中虽然也含有较多的醛酮类物质，但总量明显不及DP 和XH；枫槭浸膏GZ 以醛酮类、醇醚类、酯类（含内酯）和酚类物质为主，且醇醚类和酚类物质含量明显高于其他浸膏，而这些醇醚类和酚类物质，例如芳樟醇、松油醇、香茅醇、肉桂醇、丁子香酚甲醚、茴香脑、丁子香酚、百里香酚和香芹酚等，多表现出一定的果香或辛香特征，这可能是枫槭浸膏GZ在感官特征上区别于其余4 种的主要原因。

2.4.2 PCA 分析

为了进一步分析5 种枫槭浸膏挥发性成分之间的差异，对枫槭浸膏样品中每种挥发性成分峰面积与内标峰面积比（以下简称“面积比”）进行PCA 分析。通过交叉验证得到主成分，每个主成分均为挥发性成分面积比的线性组合，其中前3个主成分解释了变量样品差异的96.3%（PC1=48.2%，PC2=27.6%，PC3=20.5%），可以代表样品的变量特征。因此，以前3 个主成分上的得分为变量对样品作图（图9）。

图9 不同枫槭浸膏中香气成分的PCA 二维得分图(A1、B1)和载荷图(A2、B2)Fig.9 Score plot（A1，B1）and loading plot（A2，B2）of aroma components in 5 maple concrete samples

由图9 可知，PCA 二维得分图显示，通过PC1和PC2 可以区分枫槭浸膏GZ、AP 和XH，但不能区分枫槭浸膏DP 和W；通过PC1 和PC3 可以区分枫槭浸膏GZ、AP 和W，但不能区分枫槭浸膏DP和XH。这表明枫槭浸膏W、XH 分别与DP 的挥发性成分存在差异，但同时具有一定的相似性。

PCA 载荷图显示，甲基环戊烯醇酮（序号40）、对甲氧基苯乙酮（58）、苯甲酸苄酯（100）等导致枫槭浸膏AP 不同于其他4 种枫槭浸膏。3-蒈烯（2）、柠檬烯（4）、异松油烯（9）、2，4-二甲基苯乙烯（12）、对甲基苯甲醚（13）、薄荷酮（14）、薄荷醇（25）、香茅醇（35）、茴香醛（49）、柏木醇（55）、肉桂酸乙酯（57）、洋茉莉醛（68）、6-甲基香豆素（95）等导致枫槭浸膏GZ 有别于其他4 种枫槭浸膏，这些香气成分主要具有果香、辛香香韵，从而解释了枫槭浸膏GZ 在感官特征上不同于其他枫槭浸膏且表现出一定果香和辛香（图1）的现象。

3 结论

建立了市售枫槭浸膏挥发性成分分析的HS-SPME/GC-MS 方法，该方法采用质谱标准谱库结合双保留指数法进行定性，提高了挥发性成分定性结果的准确性。5 种市售枫槭浸膏共鉴定出104 种挥发性成分，其中95 种挥发性成分具有香气特征，其中香兰素、5-甲基糠醛、麦芽酚和2-乙酰基呋喃等11 种为其共有香气成分，这些成分多呈现焦香和甜香香韵，是枫槭浸膏香气特征的物质基础。通过One-way ANOVA 和PCA 分析发现：5 种市售枫槭浸膏挥发性成分存在显著差异；枫槭浸膏W、XH 分别与DP 的挥发性成分具有一定相似性；由于枫槭浸膏GZ 含有柠檬烯、茴香醛、肉桂酸乙酯等香气成分，导致其在感官特征上不同于其他枫槭浸膏且表现出一定果香和辛香香韵。