腹水综合征肉鸡空肠中LPS和短链脂肪酸的含量检测

2019-06-01赵冬冬郭宇荣申伟祺孙耀贵王文魁李宏全段智变

山西农业科学 2019年5期

赵冬冬，杨澜，郭宇荣，王卓，温爽，申伟祺，程佳，孙耀贵，王文魁，李宏全，段智变

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801）

腹水综合征（Ascites syndrome，AS）是严重威胁肉鸡行业的三大疾病之一，是一种营养代谢病。其主要的发病因素有遗传、营养、环境和药物等。AS主要发生在4～7 周龄快速生长的肉鸡[1]，其临床症状以腹水为主要特征[2]。有学者认为，AS 发病机理是肠道产氨假说，即AS 发生时肠道菌群紊乱，引起氨气产生增加，发生AS[3-4]。

哺乳动物发生腹水时，肠道菌群发生紊乱，肠道中有害菌数量增加，有益菌数量减少，导致肠道中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）含量增加，引起肠道炎症，破坏肠道黏膜屏障，有害菌及LPS 进入血液，血液中LPS 增加会损伤肝、肺等器官，造成肺动脉高压和肝门静脉高压[5]。有研究表明，肺动脉高压和肝门静脉高压是肉鸡发生腹水症的关键环节[6-7]。菌群紊乱还会引起肠道中产短链脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFA）菌丰度降低，从而引起肠道中SCFA 浓度降低，SCFA 有抗炎、营养肠道上皮细胞等作用[6]，当其水平下降，肠道黏膜屏障进一步受损，导致有害菌及LPS 易位，进一步加速腹水的产生。因此，肠道菌群紊乱引起的LPS 和SCFA 含量改变可能在AS 发生时发挥重要作用，目前国内外没有发现在肉鸡上的相关报道。

本试验通过检测AS 肉鸡肠道内容物LPS 和SCFA 含量及血清LPS 含量，探讨LPS 和SCFA 在AS 发病时的作用。

1 材料和方法

1.1 试验动物

供试肉鸡为1日龄102 羽罗斯肉鸡，购自山西省文水县大象禽业有限公司，雌雄不限。

1.2 试验方法

将1日龄肉鸡常规育雏至7日龄，随机分为2 组：空白组常规饲喂基础日粮，模型组饲养环境温度9～11 ℃，饲料中添加3%猪油和4%鱼粉，饮水中添加0.12%NaCl。于 35日龄 8：00，每组取 5 羽肉鸡称质量后进行空腹心脏采血，将血液静置自然凝固15 min左右，再离心20 min 左右，离心速度为3 000 r/min，取得上清液即为血清，于-80 ℃保存，用于测定LPS 水平。称质量后将肉鸡处死，采集空肠内容物，装入灭菌的冻存管中，迅速转移至液氮罐，待采集完毕转入-80 ℃冰箱，用于测定SCFA 和LPS 含量。

1.3 空肠内容物LPS及血清LPS检测

1.3.1 样品处理血清：用之前收集好的血清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

空肠内容物：收集样品后，用液氮迅速冷冻保存备用。检测时，将样品融化，加入一定量PBS，将标本匀浆充分，3 000 r/min 离心20 min，收集上清液。

1.3.2 LPS 水平检测设置标准品孔和样本孔，标准品孔加不同浓度标准品50，100 μL 酶标试剂，样本孔设空白孔和待测样品孔。待测样品孔依次加40 μL 稀释液、10 μL 样品液、100 μL 酶标试剂。封膜板封板，放置37 ℃温育60 min。弃去液体，每孔加满洗涤液，30 s 后弃去，重复 5 次。加入显色剂 A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，混匀37 ℃避光显色15 min。最后，加终止液50 μL。以空白孔调零，测孔吸光度。

1.4 空肠内容物SCFA浓度的检测

1.4.1 样品处理取肉鸡空肠内容物0.5 g 于2 mL离心管中，编号，然后在每个管中按照体积比1∶2.5 的比例加入1.25 mL 超纯水，漩涡振荡4～6 min，充分溶解；将离心管置于离心机中以10 000 r/min离心10 min；取1 mL 上清液放入2 mL 离心管中，编号，在每个离心管中按照体积比5∶1 的比例加入25%的偏磷酸溶液，放在冰水中，等待30 min。再放在离心机中离心10 min，取上清液1 mL 装入进样瓶，用气相色谱法检测乙酸、丙酸和丁酸浓度。

1.4.2 色谱条件色谱柱为DB-FFAP 毛细管柱；柱温升温程序：初始温度为65 ℃，20 ℃/min 升温至190 ℃；进样口温度为250 ℃；载气：氮气；载气流速：氢气 H235 mL/min，空气 350 mL/min，尾吹：40 mL/min；进样方式：分流速率 20 mL/min，进样量为 1 μL。

1.4.3 标准曲线的制作混合标准溶液为乙酸91.91 mmol/L、丙酸66.69 mmol/L 和丁酸53.75 mmol/L混合。

制备5 个浓度标准溶液（将混标依次2 倍稀释），取标准溶液1 mL 置于2 mL 离心管中，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液，充分混匀离心10 min，取1 mL 上清液置于进样瓶，用气相色谱仪进行检测，记录峰面积，峰面积为Y 轴，浓度为X 轴，制作标准曲线。

1.5 数据统计分析

数据采用One-way Anova 来检测组间差异性，并以P＜0.05 为差异具有统计学意义作为判定标准。

2 结果与分析

2.1 各组肉鸡空肠内容物LPS和血清LPS分析

由表1可知，与空白组相比，35日龄模型组肉鸡空肠内容物、血清的LPS 含量极显著升高（P＜0.01）。

表1 各组肉鸡血清和组织LPS 含量 EU/mL

2.2 肉鸡空肠内容物SCFA含量分析

2.2.1 乙酸、丙酸和丁酸标准曲线绘制乙酸、丙酸和丁酸的浓度是横坐标，气相色谱测得的峰面积是纵坐标，用Excel 绘制标准曲线。

由图1可知，乙酸、丙酸、丁酸回归方程分别为y＝0.449 8x＋0.411 9；y＝1.103 5x-0.994 7；y＝1.512 9x-1.084 7；R2值分别为 0.999 3，0.999 3，0.999 1。

2.2.2 肉鸡空肠内容物SCFA 含量由表2可知，与空白组相比，模型组乙酸、丙酸、丁酸的浓度均极显著下降（P＜0.01）。

表2 各组肉鸡短链脂肪酸的浓度 μmol/g

3 讨论

肉鸡腹水综合征严重危害肉鸡行业，主要的临床症状是肝脏肿大充血、肺部淤血、肠道及肠系膜静脉充血水肿等。本试验采用低温、高脂、高蛋白饲料及高Na+含量饮水造模，肉鸡表现出严重腹水症状。

研究表明，肺动脉高压和肝门静脉高压是AS发生过程中重要环节[6-7]。哺乳动物发生腹水症时，肠道菌群失调[8]，引起肠道中LPS 水平增多，引起肠道炎症，破坏肠道黏膜屏障，病原菌及其产物LPS 移位至肠外进入血液循环[9-10]。LPS 随血液到各脏器，引起炎症。研究表明，家兔静脉注射LPS 引起肺动脉高压，导致右心衰竭，进一步引起门静脉高压[11]；LPS 进入肝脏，直接造成门静脉高压[12]，从而加速腹水产生。本试验表明，模型组空肠内容物和血清中LPS 水平较空白组显著升高，可能损伤肝肺等器官，加速肺动脉高压和肝门静脉高压的形成，参与了AS 发展。

SCFA 是由肠道中厌氧菌对碳水化合物和难以消化的粗纤维发酵产生，包括乙酸、丙酸和丁酸等。腹水症动物肠道菌群紊乱会引起肠道中产SCFA菌群减少[13]。有研究表明，丁酸进入三羧酸循环产生能量，为肠道上皮细胞提供60%的能量[14]；丙酸、丁酸增加ZO-1，Occludin 蛋白表达或通过增加AMPK 活性，加速紧密连接的组装[15]，从而保护肠黏膜屏障；丁酸可增加十二指肠、空肠淋巴细胞和杯状细胞的数量；SCFA 降低肠道pH，对H+耐受的乳酸杆菌等有益菌存活，而对H+不耐受的大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌会被杀死[16]；丁酸促进肠道杯状细胞黏蛋白-2（MUC-2）的分泌，增强黏膜层对肠道润滑作用及减少致病菌黏附作用[17]，丁酸和丙酸增加抗菌肽表达[18]；SCFA 通过抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性来减轻肠道的炎症反应，主要是核转录因子NF-KB 活动减弱，促炎因子产生减少[19]。本研究表明，与空白组相比，模型组中乙酸、丙酸和丁酸浓度显著下降，引起肠道屏障破坏，肠道中有害菌及LPS 等有害产物进入机体，加剧肉鸡腹水产生。