紫苏二酰甘油酰基转移酶基因（PfDGAT1）鉴定及表达分析

周雅莉，任文燕，郝月茹，安 茜，段露露，李润植，王计平

（1.山西农业大学农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学分子农业与生物能源研究所，山西 太谷 030801）

紫苏（Perilla frutescens（L.）Britt.），唇形科紫苏属，为1年生草本植物[1]，是一种具有广泛开发利用前景的经济作物，是我国卫生部首批颁布的既是药品又是食品的60 种“药食同源”植物之一[2]，被广泛用作中药材和蔬菜、调味品等[3]。紫苏种子中含油量可达 35%～64%，而 ω-3 脂肪酸（C18∶3）和 ω-6脂肪酸（C18∶2）含量分别高达54%～64%和14%，是目前所发现的C18∶3 脂肪酸含量最高的特殊油料作物之一[4-7]。

二酰甘油酰基转移酶（Diacylgycerol acyltransferase，DGAT）是三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）合成的关键酶和限速酶，主要催化二酰甘油加上脂肪酸酰基生成三酰甘油[8]。对于大多数油料作物种子的TAG 合成积累具有重要作用。有研究发现，油料植物在其种子发育过程中，随着DGAT 酶活性不断加强油脂积累速度加快，而当油脂含量趋于稳定时，DGAT 活性会逐渐降低[9]。KUBIS 等[10]研究发现，在大豆（Glycine max）高油和低油品种中，大豆种子油脂积累速度、油脂含量均与DGAT 酶的活性呈正相关。HOBBS 等[11]首先在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆得到DGAT1 基因，且该基因的cDNA 在拟南芥中仅存在一个拷贝。随后，人们相继在油菜（Brassica napus）[12]、烟草（Nicotiana tabacum）[13]、大豆[14]、蓖麻 （Ricinus communis）[15]、旱金莲（Tropaeolum majus）[16]和玉米（Zea mays）[17]等植物中克隆得到DGAT1 基因。

本研究依据紫苏转录组数据库，从晋紫苏1 号中克隆得到PfDGAT1 基因全长序列，并分析该基因在紫苏不同组织中的表达特性，旨在为进一步研究PfDGAT1 基因在紫苏等油料作物油脂合成代谢过程中的作用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试紫苏品种晋紫苏1 号种植于山西农业大学农学院试验站。取不同组织器官及不同发育时期（开花后 10，20，30，40 d）的种子，液氮速冻后 -80 ℃保存备用。大肠杆菌DH5α 感受态与试验所用克隆载体pMD18-T 均保存于山西农业大学分子农业与生物能源研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 目的基因克隆 利用EASYspin RNA 提取试剂盒（RN09，艾德莱生物）提取晋紫苏1 号叶片总RNA，参考ABM 公司反转录试剂盒（5X All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit））方法进行反转录，得到cDNA 用于后续试验。依据GeneBank 中紫苏 PfDGAT1 基因序列（AF298815.1）设计扩增全长cDNA 的引物PfDGAT1-F/R 进行PCR 扩增（表1）。反应体系为20μL：模板cDNA2μL，上下游引物各 0.5 μL，10×Pfu Buffer 2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，Pfu DNA Polymerase 0.5 μL，dd H2O 12.9 μL。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，循环 30 次；72 ℃终延伸 5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR 扩增产物纯化回收并连接到pMD18-T 载体上，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，鉴定阳性克隆，送至通用生物公司（安徽）测序。

1.2.2 PfDGAT1 基因生物信息学分析 利用NCBIORF（Open Reading Frame，ORF）在线软件对 1.2.1获得的基因序列的开放阅读框进行识别，并将核酸、氨基酸进行比对[18]。利用在线软件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）对该蛋白质的基本理化性质进行分析；使用PSORTII（http:// psort.hgc.jp/form2.html）软件对该蛋白质进行亚细胞定位预测；运用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在线软件分析该蛋白质的跨膜区域，通过SOPMA（http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_autom at.pl?page=npsa_sopma.html）对其二级结构进行预测；利用NCBI-CDD（http://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/Wrpsb.cgi）预测该蛋白的功能结构域；采用SWISSMODEL（http://swissmodel.expasy.org/）在线软件对该蛋白进行三维结构分析与建模。运用在线软件PRALINE（http://www.ibi.vu.nl/programs/praline-www/）对紫苏DGAT1 蛋白与其他已公布的植物蛋白质进行多序列比对，从中找出保守域。运用MEGA 7.0 多序列比对软件对紫苏DGAT1 蛋白与其他多种高等植物氨基酸序列进行比对，并构建系统进化树。

1.2.3 实时荧光定量PCR 检测 提取晋紫苏1 号的根、茎、叶、花及不同发育时期（开花后10，20，30，40 d）种子的总RNA，反转录成cDNA。根据紫苏PfDGAT1 基因的cDNA 序列设计荧光定量PCR 特异性引物PfDGAT1-q-F/R，以紫苏18S rRNA（表1）作为内参基因[19]设计引物18S rRNA-F/R，用于实时荧光定量PCR 检测。荧光定量PCR 反应体系为10 μL：cDNA 模板 0.5 μL，EvaGreen 2X qPCR MasterMix 5 μL，正反引物各 0.3 μL，ddH2O 3.9 μL。扩增程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 60 s，40 次循环；65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s。每个样品进行 3 次生物学重复和3 次技术重复。采用2-ΔΔCt法计算紫苏PfDGAT1 基因的相对表达量[20]。

表1 引物信息

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 紫苏PfDGAT1基因全长cDNA序列的克隆

以晋紫苏1 号叶片cDNA 作为模板进行RTPCR 扩增，扩增产物电泳结果如图1所示，RT-PCR反应扩增得到1 条长度约为1 964 bp 的目的条带，与预期相符。将编码区序列与GeneBank 中紫苏PfDGAT1 基因（AF298815.1）序列进行比对，结果表明，推测的氨基酸序列与已公布PfDGAT1 基因序列（AF298815.1）无差异，说明分离获得了正确的PfDGAT1 基因的 cDNA 克隆。

2.2 PfDGAT1基因的生物信息学分析

本试验克隆获得PfDGAT1 基因序列全长为1 964 bp，开放阅读框（ORF）长度为 1 605 bp（核苷酸序列位于69～1 673），共编码534 个氨基酸残基（图2）。通过ProtParam 软件预测分析表明，PfDGAT1蛋白的分子式为C2812H4322N714O747S35，相对分子质量为61.21 ku，理论等电点（pI）为8.34，不稳定系数为46.77，亲水性系数为0.227，推导该蛋白质为疏水性不稳定蛋白。经PSORTII 亚细胞定位预测分析显示，紫苏PfPDAT1 蛋白定位于质膜的可信度为65.2%，预测其为膜锚定蛋白。

通过TMHMM 在线分析紫苏PfDGAT1 蛋白跨膜区域，结果显示（图3），PfDGAT1 蛋白有 9 个典型的跨膜螺旋区，分别位于139～158，182～201，213～235，240～262，328～350，376～398，438～460，470～492，505～527 位氨基酸之间。通过NCBI-CDD数据库分析发现，PfDGAT1 蛋白具有PLN02401（diacylglycerolo-acyltransferase）结构域，属于MBOAT超家族中的成员。

运用SOPMA 在线软件对紫苏PfDGAT1 蛋白的二级结构进行预测分析，结果显示，该蛋白二级结构的主要结构元件为α-螺旋（43.63%）和无规则卷曲（41.76%），β-转角（2.81%）和延伸链（11.80%）则分散于整个结构中。使用SWISS-MODEL 在线软件对PfDGAT1 蛋白进行三维结构分析与建模，结果如图4所示。

通过对紫苏PfDGAT1 蛋白与其他植物DGAT1蛋白进行多序列比对发现，紫苏PfDGAT1 蛋白与其他植物蛋白一样，具有9 个典型的结构域，分别是酰基辅酶A 结合位点、拟南芥突变体AS11 串联重复序列、催化活性位点、磷酸泛酰巯基乙胺附着位点、蛋白激酶1 靶标位点、硫酰基酶中间体结合位点、脂肪酸结合蛋白标签、甘油二酯结合位点、内质网定位保守域。系统进化树分析结果显示（图5），紫苏PfDGAT1 蛋白与芝麻、油橄榄的亲缘关系较近，且序列同源性分别为89%，83%，与大豆和鹰嘴豆的亲缘关系较远，表明DGAT1 蛋白在进化上具有高度保守性。

2.3 紫苏PfDGAT1基因表达特性分析

利用荧光定量PCR 技术分析紫苏PfDGAT1 基因在晋紫苏1 号根、茎、叶、花及不同发育时期种子中的表达特性，结果表明（图6），PfDGAT1 基因在紫苏不同组织中均有表达，在种子中表达量最高，在茎和花中的表达量次之，在根中基本不表达，且随种子发育该基因表达量呈先升高后降低的变化趋势，且在开花后20 d 达到最高。以根为对照，PfDGAT1 基因在茎、叶、花中的表达量分别是根中的 11.82 倍、1.77 倍和 8.57 倍，在开花后 20 d 的种子中该基因的表达量是根中表达量的36.29 倍。

3 结论与讨论

二酰甘油酰基转移酶（DGAT）是TAG 合成最后一步反应的关键限速酶，有研究表明，植物DGAT1 蛋白一般具有 9～10 个跨膜结构域[13，21]。本研究使用含油量较高的紫苏品种晋紫苏1 号作为试验材料，克隆获得PfDGAT1 基因后，分析该基因序列特征及编码蛋白基本性质，结果发现，紫苏PfDGAT1 蛋白具有9 个典型的跨膜螺旋区，这与前人研究结果一致[21]。多序列比对结果发现，PfDGAT1蛋白具有酰基辅酶A 结合位点、拟南芥突变体AS11 串联重复序列、催化活性位点、磷酸泛酰巯基乙胺附着位点、蛋白激酶1 靶标位点、硫酰基酶中间体结合位点、脂肪酸结合蛋白标签、甘油二酯结合位点、内质网定位保守域等9 个功能结构域，这与 HOBBS 等[11]，ZOU 等[22]，HE 等[23]，BOUVIER 等[13]，NYKIFORUK 等[24]对植物DGAT1 蛋白功能位点预测结果一致。

MURPHY 等[25]研究发现，DGAT 广泛分布于植物的各个组织中，其活性在植物的花及发育的种子中最高。本试验利用荧光定量PCR 分析PfDGAT1基因在紫苏不同组织器官中的表达特性，结果显示，PfDGAT1 基因在紫苏不同组织中均有表达，其中，在种子中表达量最高，在茎和花中的表达量次之，在根中基本不表达，且随种子发育，该基因表达量呈现先升高后降低的变化趋势。王计平等[19]研究发现，在紫苏种子发育过程中，其总脂肪酸含量逐渐升高，且PfDGAT1 基因表达量先升高后下降，与本研究结果基本一致，表明PfDGAT1 基因在紫苏脂肪酸合成积累中发挥重要作用。

本研究克隆得到紫苏PfDGAT1 基因cDNA，该序列全长 1 964 bp，其中，CDS 为 1 605 bp，共编码534 个氨基酸，预测PfDGAT1 基因编码定位于细胞质膜，具有典型的DGAT1 功能结构域，包含9 个典型的跨膜螺旋区。多序列比对和系统进化树分析结果表明，PfDGAT1蛋白与芝麻、油橄榄的DGAT1 蛋白的亲缘关系较近。qRT-PCR 结果表明，PfDGAT1基因在紫苏根、茎、叶、花及种子发育不同阶段均有表达，且在种子中表达量最高，PfDGAT1 基因表达量随种子发育呈先升高后降低的变化趋势。