2种高效液相色谱法测定小米中黄色素的比较

王 喆，郝瑞丽，陈利青，马芳芳，韩渊怀，3，张 彬，3

（1.山西农业大学农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学生物工程研究所，山西 太谷 030801；3.杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太谷 030801）

随着人们生活品质的提高，越来越多的人开始注重养生，由于杂粮具有保健功能[1-3]，人们对杂粮的需求量也越来越大，与此同时，对其品质的要求也越来越高。谷子（Setaria italica）作为我国古老且种植面积最大的杂粮作物之一[4-5]，主要分布在干旱和半干旱地区[6]，其营养价值很高，含丰富的矿质元素和维生素，它不仅供食用，还有药用功能[7]。谷子脱壳之后称为小米，有黄、白、绿等颜色。经统计，在众多米色性状中，黄米居多。有研究表明，米色是衡量小米品质的重要指标，小米米色越黄，米饭的口感越好[8-9]，而小米中的黄色素含量对其外观品质有很大的影响[10]，而且许多食品的着色剂中都有小米黄色素[11-12]。因此，挖掘一种测定黄色素更加高效、准确的方法具有十分重要的意义。

目前，对于小米中黄色素的研究并不多[10]。王海棠等[13]通过从小米中提取黄色素，确定了其主要化学成分，并发现这些成分对光和酸较敏感，对氧化还原反应和热反应具有一定的稳定性，但由于条件有限，并没有准确测出黄色素的组成成分[14-15]。贾鹏禹等[10]通过多种化学技术分析小米黄色素，发现其化学成分与玉米黄色素基本相同，属天然类胡萝卜素。刘晓庚等[16]研究表明，类胡萝卜素在深色谷物含量较多。李福乾等[17-22]的研究中详细介绍了类胡萝卜素的理化性质及生理功能。李赫等[23]的研究中用C18 反相液相色谱分析法分离类胡萝卜素类物质，效果良好；惠伯棣等[24]通过采用C30 反相液相色谱法分析类胡萝卜素类物质，发现该方法在异构体分辨和分析专属性方面比C18 更好。

近年来，随着黄色素越来越多地应用于生产实践[25-27]，黄色素的相关研究也越来越多。研究测定黄色素的方法不仅可以为食品安全测定提供依据，且可以加快高品质育种进程[28-30]。如C18 柱对非极性类胡萝卜素顺/反异构体的能力比C30 柱的分离差[24]，而C30 柱需要与适合的洗脱模式结合才能达到良好的分离效果。目前，关于测定黄色素及其组分含量的方法鲜见报道。

本研究以黄、白、绿3 种颜色的小米品种为试验材料，通过2 种高效液相色谱法分离出黄色素的主要成分，并测定各成分的含量，探究其含量对米色的影响，以期建立一种更加合理、高效的测定黄色素主要组分及含量的方法，为今后选育高叶黄素谷子品种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料和试剂

1.1.1 试验材料 试验材料为晋谷21 号（JG21）、支生谷（ZSG）和大青谷（DQG），其中，晋谷 21 号为山西省农业科学院经济作物研究所通过对晋汾52号进行60Coγ 射线辐射诱变选育而成，其品质极好，不仅外观看上去金灿灿的很诱人，蒸煮后还有饭香且口感好，因此，大家认为其为顶级米质，曾5 次获全国农博会优质谷米金奖[31-32]。支生谷和大青谷为农家品种，其小米米色呈白色和绿色。

1.1.2 试验试剂 水饱和正丁醇、甲醇（色谱纯）、MTBE（甲基叔丁基醚）、水（娃哈哈纯净水）、叶黄素和玉米黄质标准品（均购自Sigma 公司）。

1.2 仪器

砻谷机；电子天平；HY-4 型调速多用振荡器（苏州培英实验设备有限公司）；离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；紫外可见光分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；高效液相色谱仪。

1.3 高效液相色谱法一[33-34]

本试验对文献[33-34]的方法进行了适当调整，如样品处理方法其采用的是先烹饪，而本试验采取的是直接研磨取样，操作简单；类胡萝卜素提取方法不同，其采用甲醇提取该物质，本试验则用水饱和正丁醇参照AACC 法提取；色谱柱不同等。

1.3.1 总类胡萝卜素的提取 提取液制备：将纯净水和正丁醇按体积比1∶1 均匀混合，然后静置分层，上层即为水饱和正丁醇。

各称取2.0 g 研磨好的样品，分别加入10 mL水饱和正丁醇，振荡30 s，使其充分混匀，避光保存。在室温下摇3 h，4 000×g 离心10 min 后取上清，即为类胡萝卜素提取液。通过分光光度计分别测3 个品种在450 nm 处的吸光值，从而得到总类胡萝卜素含量。

1.3.2 样品上机前处理 取适量类胡萝卜素提取液，过0.22 μm 滤膜。前2 滴弃去，剩下的用于样品高效液相色谱分析。

1.3.3 测定玉米黄质和叶黄素含量的高效液相色谱（HPLC）分析

1.3.3.1 色谱条件 色谱仪：ACQUITY UPLC 超高效液相色谱系统；色谱柱：Thermo Scientific Syncronis C18 超高效液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：流动相A 为MTBE∶甲醇∶水＝15∶81∶4（V/V/V），流动相 B 为 MTBE∶甲醇＝90∶10（V/V）；流速：0.4 mL/min，柱温：35 ℃，检测波长：448 nm。

1.3.3.2 洗脱条件 梯度洗脱：在0～3 min，流动相B 的体积百分比为0；在3～4 min，流动相B 的体积百分比由0 变到100%；在4～5 min，流动相B 的体积百分比为100%；在5～5.3 min，流动相B 的体积百分比由100%变到0。

1.4 高效液相色谱法二[35]

根据文献[35]的方法进行，但略有改进，例如，样品处理方法不同，其先清洗，然后冷冻干燥，并去壳3 次，研磨，而本试验直接去壳1 次，研磨，相对节约时间；其研磨完毕要筛细粉，本试验不需要。

1.4.1 总类胡萝卜素的提取 各取适量谷子用砻谷机脱壳，把没脱壳的、碎的小米和其他杂质挑掉，将小米在咖啡机中研磨。分别称取研磨充分的小米粉0.6 g 于10 mL 洁净离心管中（外壁用锡箔纸包裹以避光），加入6 mL 水饱和正丁醇，快速振荡使其充分混匀，用封口膜封住，放置在HY-4 型调速多用振荡器上室温振荡3 h，后于4 ℃8 000 r/min条件下离心15 min，将其轻轻取出，收集上清，注意不要吸到沉淀。其中一部分用于高效液相色谱分析，另一部分用来测定总类胡萝卜素含量。以水饱和正丁醇为参比，使用紫外可见分光光度计测定样品在450 nm 波长下的吸光值，每个样品做2 次重复，整个过程在避光条件下进行。

其中，A 为波长 450 nm 处吸光值；V 为提取液体积（mL）；m 为样品质量（g）。

1.4.2 样品上机前处理 从备好的类胡萝卜素提取液中用新的注射器吸取0.5～1 mL 溶液，经过滤器进行过滤后，放到液相色谱专用瓶子中备用。

1.4.3 测定玉米黄质和叶黄素含量的高效液相色谱（HPLC）分析

1.4.3.1 色谱条件 色谱仪：高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific，Ultimate 3000）；色谱柱：C30 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；YMC 公司，Japan）；流动相：流动相 A 为MTBE∶甲醇∶水＝15∶81∶4（V/V/V），流动相B 为MTBE∶甲醇＝ 90∶10（V/V）；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：450 nm；进样量：20 μL。

1.4.3.2 标准工作曲线绘制 母液制备：用水饱和正丁醇将1 mg 玉米黄质和叶黄素标准品溶解（玉米黄质 250 μL，叶黄素 200 μL），然后混匀，用锡箔纸包裹配置好的标准品母液，使其避光，并置于-80 ℃冰箱保存备用。

标准工作液制备：用水饱和正丁醇将玉米黄质和叶黄素标准品按一定浓度梯度稀释，玉米黄质分别为 32，16，8，1.6，0.32，0.16，0.08 μg/mL；叶黄素分别为 44，22，11，2.2，0.44，0.22，0.11 μg/mL。

标准曲线绘制：将水饱和正丁醇稀释好的标准品溶液按浓度从小到大依次上机，从而获取各样品浓度对应的色谱图。根据峰面积定量，保留时间定性，以进样浓度（μg/mL）为横坐标、峰面积（mAU/min）为纵坐标，进行线性回归，从而得到对应的回归方程。

1.4.3.3 洗脱条件 梯度洗脱：在0～20 min，流动相B 的体积百分比由0 变到22.2%；在20～25 min，流动相B 的体积百分比由22.2%变到0；在25～30 min，流动相B 的体积百分比为0。

2 结果与分析

2.1 2种高效液相色谱方法比较

从表1可以看出，方法2 的样品用量和提取液用量均少于方法1 所用的量，从而节约了试验材料和试验试剂，也相对节约了操作时间。

表1 谷子叶黄素和玉米黄质含量测定方法的比较

2.2 叶黄素和玉米黄质的回归方程、线性范围与检测限

表2 叶黄素和玉米黄质线性回归方程

对玉米黄质和叶黄素进行了线性范围考察，根据峰面积（Y）分别对其浓度（X）（μg/mL）进行线性回归分析，进而说明试验结果的可靠性。由表2可知，不同方法的2 种物质具有显著的线性相关性，相关系数均大于0.997。方法2 的检测限与贾鹏宇等[10]的研究结果（0.3～0.4 μg/mL）相比较低，说明方法2 对叶黄素和玉米黄质检测的灵敏度更高。

2.3 样品测试结果比较

2.3.1 2 种方法样品分离情况 以晋谷21 号、支生谷、大青谷3 个品种作为试验材料，分别运用方法1 和方法2 测定3 个品种的黄色素含量，进一步比较验证了2 种高效液相色谱方法。

以JG21 为例，叶黄素和玉米黄质的分离情况根据标品保留时间定性。从图1可以看出，2 种方法均可将这2 种物质分离开。但是方法2 中叶黄素和玉米黄质保留时间分别约在10，11 min，方法1的保留时间则约为23，25 min，可见方法二的灵敏度更高。另外，方法2 的定性结果与王海棠等[13]的定性研究结果较为一致，可见方法2 比较可靠。在2 号峰后面还有一些小峰，但由于条件有限，无法对其定性，需要采用核磁共振或液相色谱与串联质谱联用技术进一步研究。

2.3.2 叶黄素和玉米黄质含量比较 本试验测定了3 个小米品种中黄色素的主要组分含量，并对2 种测定方法的检测结果进行了比较。由表3可知，2 种方法均能满足叶黄素和玉米黄质的检测，但检测结果存在差异。方法2 检测叶黄素和玉米黄质的含量均高于方法1，说明方法2 较方法1 效果更好。

表3 2种方法测定不同谷子品种中叶黄素和玉米黄素的含量 mg/kg

从表3可以看出，各品种叶黄素含量均高于玉米黄质含量。此外，2 种方法测出的JG21 的叶黄素和玉米黄质含量均高于ZSG 的，而ZSG 的叶黄素和玉米黄质含量又均高于DQG，该结果均与贾鹏禹等[10，14，35]的研究结果一致，说明方法 2 检测结果的准确性更可靠。因此，可以推测，小米中叶黄素、玉米黄质含量均与黄色素含量呈正相关，即小米中叶黄素或玉米黄质含量越多，黄色素含量越多，小米越黄，品质越好。

3 结论与讨论

本研究经过2 种高效液相色谱法对3 个米色的小米品种中黄色素含量分析发现，2 种方法均能在30 min 内完成叶黄素和玉米黄质良好分离，C30柱可对2 个成分进行更好的分离，这与EMENHISER 等[36]研究结果一致，证实了C30 柱具有分辨异构体构型的优点。且方法2 的定性结果与王海棠等[13]的研究结果较为一致，可见方法2 比较可靠。此外，对于3 种小米中黄色素含量的高低，本研究与贾鹏禹等[10，14，35]的研究结果一致，再次证实黄色素确实对米色有影响，而且黄色素含量越多，小米越黄，小米品质越好；但杨延兵等[4]对黄米和绿米的黄色素含量测定结果表明，绿米中的黄色素含量相对较多，这与本试验所得结果不一致，可能是由于试验材料的时期不同或试验方法不同导致，具体原因有待进一步研究。

本研究中，叶黄素和玉米黄质含量均与米色呈正相关。通过比较2 个方法发现，方法2 具有省材、省时，操作简单，且重复性好，灵敏度高，结果相对稳定的优点。因此，可进一步探究黄色素其他成分与米色的关系，并将其应用在小米品质改良中。