不同产地火绒草HPLC 指纹图谱的建立及化学模式识别

赵 玥， 齐 越， 单国顺， 王光函， 王 冰∗

（1. 辽宁中医药大学， 辽宁 大连 116600； 2. 辽宁省中医药研究院， 辽宁 沈阳 110034）

火绒草目前还未被《中国药典》 收载， 长久以来没有法定的标准来衡量， 该野生资源丰富， 不同生长地区的环境有很大的差距， 光照、 年积温、降水量、 土壤质地等生态因子都可能造成其外部形态和内在质量发生变化[5-6］。 由于中药成分复杂，个别成分的测定不能完全代表其质量的复杂体系，因此选用多指标质量控制模式来全面反映所含化学成分的种类和数量， 从而体现整体性和综合作用。本研究采用HPLC 法对辽宁、 河北等26 个产地35批火绒草进行指纹图谱研究， 通过与对照品比对、相似度评价、 主成分分析、 聚类分析等识别技术进行分析， 以期为其质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； 电子天平（万分之一，上海上天精密仪器有限公司）； HH 系列恒温水浴锅（江苏金坛仪器厂）。 数据分析采用软件中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004、 SPSS Statistics 20.0 软件。

1.2 试药 咖啡酸 （Y17D6C7672）、 绿原酸（R055F6F1）、 阿魏酸（H25M6L1）、原儿茶酸（Z30M6L1）、原儿茶醛 （Y01013FB14） 对照品，含有量均＞98%， 均购于上海源叶生物科技有限公司。 乙腈、 磷酸为色谱纯； 其他试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

26 个产地火绒草共35 批， 其中3 批购于安国药房， 其余采自各地， 由辽宁中医药大学王冰教授鉴定为正品， 见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B）， 梯度洗脱（0 ～10 min， 10% ～12% B； 10 ～20 min， 12% ～14% B； 20 ～30 min， 14% ～16% B；30 ～40 min， 16% ～22% B； 40 ～50 min， 22% ～30% B； 50～80 min， 30% ～52% B）； 柱温25 ℃；体积流量1 mL／min； 检测波长290 nm。

2.2 供试品溶液配制 取各产地火绒草剪切成段，各精密称定1 g 置锥形瓶中， 加入50%乙醇25 mL，称定质量， 回流提取1 h， 放冷， 50%乙醇补足减失的质量， 过滤， 取续滤液， 0.45 μm 微孔滤膜过滤， 取续滤液， 即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取绿原酸、 咖啡酸、阿魏酸、 原儿茶醛、 原儿茶酸适量， 加甲醇溶解制成 质 量 浓 度 分 别 为1.30、 1.66、 1.18、 1.04、1.34 mg／mL 的贮备液， 分别吸取0.5 mL 定容至10 mL 量瓶中， 即得。

2.4 方法学考察

101A-1型数显电热恒温鼓风干燥箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司产品；JA503型电子天平，常州市幸运电子设备有限公司产品；JY92-Ⅱ型超声波细胞破碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；DZ-260T型DZQ系列真空包装机。

2.4.1 精密度试验 取同一火绒草 （S1）， 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次， 选取绿原酸作为参照峰，测得特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD 均小于3%， 表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一火绒草（S1） 5 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1”项色谱条件下进样， 测得各特征峰的相对保留时间、 相对峰面积RSD 均小于3%， 表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品（S1） 溶液，在“2.1” 项色谱条件下于0、 2、 6、 8、 12、 24 h进样， 测得各特征峰的相对保留时间、 相对峰面积RSD 均小于3%， 表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立 35 批不同产地、 采收期火绒草按“2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1”项色谱条件下进样， 并将所测的数据导入中药色谱指纹图谱相似度计算软件（2012 版）， S1 号样品色谱图中色谱峰峰形、 分离度良好， 基线平整， 故选择其作为参照谱图， 经多点校正后自动匹配生成的对照指纹图谱， 见图1～3， 共获得19 个共有峰，通过比较样品和对照品色谱分析保留时间及紫外吸收谱图区， 确定绿原酸、 原儿茶醛2 种共有成分；5 个对照品没有完全被指认为共有峰， 可能是不同产地药材中成分差异造成的。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

图1 样品HPLC 指纹图谱共有模式Fig.1 Common pattern of HPLC fingerprints of samples

2.6 指纹图谱分析

2.6.1 相似度评价 不同产地火绒草相似度见表2。 结果表明， 35 批样品与对照图谱的相似度较高， S19 鞍山、 S26 青海玛沁县、 S28 河北空中草

图2 对照品HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances

图3 35 批样品HPLC 指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints of thirty-five batches of samples

表2 35 批样品相似度Tab.2 Similarities of thirty-five batches of samples

原景区的相似度相对较低， 分别为0.898、 0.893、0.819， 其余均大于0.9； S1 ～S11 均为铁岭市采集， 相似度RSD 在2.27%以下， 表明采于当地者质量均一性较好； S12 ～S15 为5 月至8 月沈阳产地， 相似度RSD 在1.21%以下， S22～S25 为5 月至8 月葫芦岛产地， 相似度RSD 在2.45% 以下，表明不同产地、 采收期样品虽基本类似， 但在质量上存在一定差异， 沈阳产地质量均一性好于葫芦岛产地。

2.6.2 化学成分分析 不同产地样品共19 个共有峰， 不同样品同一共有峰的峰面积RSD 较大， 均大于50%， 表明所含成分种类相似， 但含有量差异明显。 以不同产地样品已指认有效成分（峰2为原儿茶醛， 峰3 为绿原酸） 峰面积之和作图，比较其含有量变化， 结果见图4， 可知S23 葫芦岛产地最低， S31 河南三门峡产地最高； 不同采收期样品中， 沈阳祝家产地7 月、 葫芦岛产地5 月最高， 表明不同产地、 采收期样品化学成分变化显著， 药材质量有很大差异。

图4 不同产地样品2 种有效成分峰面积总和Fig.4 Peak area sums of two kinds of effective components in samples from different growing areas

2.6.3 聚类分析 利用SPSS 20.0 软件进行系统聚类分析， 将19 个共有峰峰面积标准化后进行聚类分析， 结果见图5， 可知除去沈阳祝家镇及葫芦岛产地的5 月至7 月样品， 剩余29 批整体可分为2大类， S4、 S26、 S27、 S31、 S32 被归为一类， 其他产地被归为一类， 即青海省、 河南省、 辽宁昌图县泉头镇归为一类， 辽宁省其他产地、 河北省归为一类。 由此表明， 产地相同或地理位置相近的样品被聚在一起， 与相似度结果基本一致。

图5 29 批样品树状图Fig.5 Dendrogram of twenty-nine batches of samples

2.6.4 主成分分析 为进一步探讨不同产地样品之间的差异， 在相似度和聚类分析的基础上， 对指纹图谱数据进行主成分分析， 以标准化后的共有峰峰面积为变量， 利用SPSS20.0 软件进行处理。 结果见表3。

以特征值大于1 为提取标准， 得前4 个成分累计贡献率为88.853%， 代表了火绒草19 个共有变量88.853%的信息量， 具有较好的代表性， 由载荷矩阵获得的载荷图见图6。 由图可知， 距离原点较远的几个点为主成分中权重值最大的成分， 表明其在区分指纹图谱差异中起决定性作用。

表3 相关矩阵Tab.3 Correlation matrices

图6 各成分载荷图Fig.6 Loading diagram of various constituents

以各主成分相应贡献率为权重系数， 对各产地样品进行综合评价， 得综合得分及排序情况， 见表4。 由表可知， 铁岭昌图泉头镇（S4） 产地综合评分最高， 表明其成分含有量较其他批次高， 与聚类分析所得结果吻合， 即2 种手段可互为佐证。

3 讨论

3.1 条件优化 本实验对检测波长、 流动相、 提取方式、 溶剂、 时间进行考察， 通过HPLC-DAD检测器全波长扫描， 综合考虑共有峰的高度、 数量、 对照品最大吸收波长， 最终确定检测波长为290 nm。 考察甲醇、 乙醇2 种溶剂及提取时间30 min、 1 h、 2 h， 优化出最佳工艺为火绒草用50%乙醇回流提取1 h。 考察甲醇-水、 乙腈-水、乙腈-磷酸等流动相系统， 最终选择乙腈-磷酸， 此条件下各色谱峰保留时间适中， 数量较多， 分离度较好， 基线稳定， 能体现更多火绒所含成分， 有利于指纹图谱的建立与分析。

3.2 结果分析 已有文献报道采用化学识别模式对中药材进行指纹图谱研究[7-13］， 能充分体现药材整体特征。 聚类分析根据药材化学成分， 能将其所属类别准确划分； 主成分分析可筛选出共有特征成分， 找出决定性因素， 并得到综合得分和排名， 两者相互结合相互补充， 更加有利于客观地评价中药材真伪及其质量优劣。

表4 各样品综合得分及排序Tab.4 Comprehensive scores and ranks of various samples

本实验采用指纹图谱相似度分析、 聚类分析、主成分分析对不同产地、 采收期火绒草共有峰进行对比研究， 结果表明大部分产地样品相似度较高；不同产地、 相同采收期质量不均一， 有一定差异性； 不同产地药材明显分为2 类， 辽宁铁岭昌图泉头镇、 青海省、 河南省归为一类， 辽宁其他地区、河北省归为一类。 各产地气候、 地理位置等生态环境的不同直接影响到药材次生代谢产物（化学成分） 积累， 从而造成不同产地样品质量参差不齐，因此生态环境相似或地理位置相近的产地被归为一类。 综上所述， 本实验建立火绒草HPLC 指纹图谱， 可为该药材品质评价和质量控制提供参考依据。