高寒草甸牧草内生解淀粉芽胞杆菌261MY6发酵工艺优化

李统华, 冯中红, 杨成德

(甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

东祁连山位于甘肃、青海交界处，青藏高原边缘[1]。由于人类长期干扰和空气稀薄、太阳辐射强烈等恶劣的自然条件使其形成了脆弱的高寒草甸生态系统，高寒草甸牧草及内生菌是其重要组成部分，维持着生态系统的平衡。牧草内生细菌可溶磷、固氮和分泌IAA[2-3]，从而促进宿主植物生长发育，提高宿主植物的产量及抵抗逆境(抗寒、耐热和抗病虫害)的能力[4]。解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是农业生产常用的根际促生菌和益生菌，对促进植物生长发育和生物防治有着显著的作用[5-6]，生物学功能多样且效力显著的内生解淀粉芽胞杆菌对生物防治的研究意义重大。目前，国内外已有大量的学者对解淀粉芽胞杆菌进行研究，Hyo-Song等[7]报道了解淀粉芽胞杆菌KB3通过产生脂肽等物质对病原真菌起到了抑制作用；Torres等[8]报道了解淀粉芽胞杆菌PGPBacCA1对菌核病菌(Sclerotiumrolfsii)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)和青霉属(Penicilliumspp.)有抑制作用；刘泉成等[9]报道了解淀粉芽胞杆菌对玉米4种病害病原菌有广谱的抑制作用；张荣胜等[10]报道了解淀粉芽胞杆菌Lx-11发酵上清液对水稻植株的生长具有明显的促进作用。前期研究发现解淀粉芽胞杆菌261MY6对马铃薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、马铃薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)、孜然根腐病菌(F.Solani)、黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、马铃薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)和番瓜根腐病菌(Fusariumsp.)的抑制率均在50%以上，其中对马铃薯褐腐病菌抑制率高达96.10%。因此，本研究测定高寒草甸牧草内生解淀粉芽胞杆菌261MY6的生物学特性，并结合单因素试验和正交设计试验对其发酵培养条件进行优化，以期为解淀粉芽胞杆菌261MY6规模化生产，开发生物农药新型菌剂和下一步作为生物农药开发登记奠定基础，并为进田间试验提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

培养基：NA培养基；PDA培养基；NB培养液，配方详见参考文献[11]。

供试碳源：蔗糖、玉米淀粉、水溶性淀粉、麦芽糖、乳糖。

供试氮源：尿素、(NH4)2SO4、KNO3、NH4Cl、酵母膏。

无机盐离子：MgSO4、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、CaCl2均为国产分析纯。

1.2 菌株生物学特性的研究[12]

1.2.1生长温度测定 1) 最低最高温度测定分别设低温梯度0，2，4，6，8，10，12，14，16℃和高温梯度45，47，49，51，53，55，57，59，61℃，将菌株261MY6接种于NA斜面培养基上进行划线并置于不同温度培养箱中培养24 h，观察其生长情况。

2) 致死温度测定将0.1 mL待测菌株培养液接于装10 mL NB培养液的试管中，分别经90，91，92，93，94，95，100，105和110℃的高温处理10 min后，取100 μL菌悬液均匀涂布于NA平板上，并于28℃培养箱中培养，48 h后观察记录菌落生长情况。

3) 最适温度测定取0.1 mL待测菌株培养液接于装10mL NB培养液的试管中，以接无菌水培养液为对照，分别置于22，24，26，28，32，34和36℃的180 rpm摇床培养，24 h后测定OD600。

1.2.2最适pH测定 取0.1 mL待测菌株培养液接于装10mL NB培养液的试管，设pH值3，4，5，6，7，8，9，10和11，以无菌水培养液为对照，于28℃、180 rpm摇床中培养，12 h后测定OD600，检测最适pH。

1.2.3生长曲线测定 取0.1mL待测菌株培养液接于装10 mL NB培养液的试管中，以接无菌水的培养液为对照，分别设温度22，24，26，28，32，34和36℃，于转速为180 rpm的摇床(pH生长曲线测定时温度为28℃)中进行培养，并测定记录OD600。检测生长曲线时前3 h每隔30 min测一次，3 h后每隔1 h测一次，后制作生长曲线；24 h后检测最适温度。

以上处理与对照均3次重复。

1.3 发酵培养基优化

种子液制备：将已活化的新鲜待测生防菌接至NB培养液(100 mL/150 mL三角瓶)中，振荡培养(180 rpm，28℃)24 h，制得种子液。

最佳碳、氮源及无机盐离子的筛选：分别用不同供试碳源、氮源和无机盐等量替换基础发酵培养液(40 mL/150 mL三角瓶)中的葡萄糖、蛋白胨和氯化钠，以基础发酵培养液为对照，灭菌后接入2 mL种子液，振荡培养(180 rpm，28℃) 24 h，以测定不同发酵液吸光度值(OD600)来确定最佳碳源、氮源和无机盐离子。

正交试验设计：根据单因素试验筛选结果，将得出的最佳碳、氮源和无机盐离子按不同浓度进行3因素3水平的正交试验，其他步骤同上，分析试验结果，明确最优培养基组合(表1)。

表1 L9(33)正交试验设计Table 1 The design of L9(33) orthogonal experiment

摇瓶发酵条件优化：在最优培养基的基础上，设定不同的发酵参数，pH值：6，6.5，7，7.5和8，温度：20，24，28，32和36℃，摇床转速：120，150，180，210，240和270 rpm，接种量：2%，6%，10%，14%和18%，最佳供氧量为装液量150 mL三角瓶中分装20,40,60,80和100 mL培养液，并在以上各条件下培养24 h后，测定OD600，明确最佳优化条件。

100 L发酵罐放罐时间确定：在筛选得到的最佳培养基、温度、转速和供氧量等的基础上，对生防菌株进行100 L发酵罐连续放大培养，每隔3 h取样，测定OD600，确定最佳放罐时间。

以上处理与对照均3次重复。

1.4 数据处理

利用Excel2010，SPSS19.0等软件进行试验设计与数据处理。

2 结果与分析

2.1 生防菌株生物学特性的研究

2.1.1最低、最高、致死和最适生长温度的测定 菌株261MY6在低于4℃或高于56℃时菌株不再生长，在95℃水浴10 min后涂于NA平板上48 h后未发现菌落，在28～36℃时OD600显著高于其他温度(P<0.05)。说明菌株261MY6生长最低、最高、致死和最适温度分别均为4，56，95和28～36℃。

2.1.2菌株生长pH值测定 由图1知，菌株261MY6在pH值为4及以下时其生长明显受限，pH值为5～7时生长良好，在pH值超过8时，生长减缓，pH值达到11时，不再生长。说明261MY6菌株最适pH为5～7。

2.1.3菌株生长曲线 菌株261MY6在0～5 h生长不明显，在5 h后均进入对数期，在10 h后进入稳定期，约在30 h时菌株生物量上升到最大值，在34 h后进入衰退期(图2)。

图2 生防菌株261MY6生长曲线Fig.2 The growth curve of the antagonistic strain 261MY6

2.2 碳、氮源及无机盐离子的筛选

2.2.1碳、氮源及无机盐离子种类的筛选 经单因素试验筛选适宜生防菌株生长所需的碳、氮源和无机盐离子。菌株261MY6在碳源为乳糖时生物量(OD600)显著大于其他碳源(P<0.05)(图3)，说明菌株261MY6生长最适碳源为乳糖；菌株261MY6氮源为酵母膏时生物量(OD600)显著高于其他氮源(P<0.05)，其中尿素对261MY6菌株的生长表现出显著的抑制作用(图4)，说明菌株261MY6生长最适氮源为酵母膏；菌株261MY6在无机盐为MgSO4时生物量(OD600)显著大于其他无机盐(P<0.05)，而CuSO4与MnSO4对261MY6菌株有显著的抑制作用(图5)，说明菌株261MY6生长最适无机盐为MgSO4。

图3 碳源对生防菌株261MY6生长的影响Fig.3 Effects of carbon sources on the growth of antagonistic strain 261MY6注：小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同;1:蔗糖；2.玉米淀粉；3.可溶性淀粉；4.麦芽糖；5：乳糖；6：不加糖；7：CKNote:Lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below;1:Sucrose;2:Corn starch;3:Soluble starch;4:Maltose;5:Lactose;6:No Sugar;7:CK

图4 氮源对生防菌株261MY6生长的影响Fig.4 Effects of nitrogen sources on the growth of antagonistic strain 261MY6注：1：尿素；2：(NH4)2SO4；3：KNO3；4：NH4Cl；5：酵母膏；6：不加氮；7:CKNote:1.Urea;2:(NH4)2SO4;3:KNO3;4:NH4Cl;5:Yeast Extract;6.No Nitrogen;7:CK

图5 无机盐对生防菌株261MY6生长的影响Fig.5 Effects of inorganic ions on the growth of antagonistic strain 261MY6注：1：MgSO4；2：KH2SO4；3：MnSO4；4：CuSO4；5：CaCl2；6：不加盐；7：CKNote: 1：MgSO4；2：KH2SO4；3：MnSO4；4：CuSO4；5：CaCl2；6：No Ions；7：CK

2.2.2碳、氮源及无机盐离子浓度的筛选 对2.2.1中筛选所得碳、氮源及无机盐离子的浓度做进一步优化。菌株261MY6在碳源浓度乳糖25 g·L-1、氮源酵母膏浓度6 g·L-1和无机盐浓度MgSO44 g·L-1时生物量(OD600)显著高于其他浓度(P<0.05)，说明菌株261MY6最适碳源浓度为乳糖25 g·L-1、氮源酵母膏浓度为6 g·L-1、无机盐浓度为MgSO44 g·L-1(图6,7,8)。

图6 碳源浓度对生防菌株261MY6生长的影响Fig.6 Effects of concentrations of carbon sources

图7 氮源浓度对菌株261MY6生长的影响Fig.7 Effect of concentrations of nitrogen sources on the growth of antagonistic

图8 无机盐离子浓度对菌株261MY6生长的影响Fig.8 Effect of concentrations of inorganic ions on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.3 正交试验

正交试验优化了适宜菌株261MY6生长的碳、氮源和无机盐离子的浓度配比，菌株261MY6在乳糖25 g，酵母膏7 g，MgSO43 g，水1000 mL时生物量(OD600)显著高于其他配比(P<0.05)。结果表明，最适菌株261MY6生长的碳、氮源和无机盐离子的浓度配比为牛肉膏3 g、乳糖25 g，MgSO43 g，酵母膏7 g，水1000 mL(表2)。

表2 正交试验优化结果Table 2 Orthogonal tentative results

2.4 摇瓶发酵条件的优化

2.4.1最适pH值筛选 菌株261MY6在pH值为5和6时的生物量(OD600)差异不显著(P>0.05)，此时生长缓慢，到pH为7时生物量最高(OD600最大)，且显著大于其他pH值下的生物量(P<0.05)，后又迅速下降；说明了菌株261MY6生长的最适pH值为7(图9)。

图9 pH对生防菌株261MY6生长的影响Fig.9 Effect of pH on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.4.2最适温度筛选 由图10知，菌株261MY6的生物量在20～28℃之间随着温度的上升而升高，32℃时OD600达到最大，且OD600显著大于其他温度条件下的(P<0.05)。因此，适宜菌株261MY6的最适温度为32℃。

2.4.3最佳接种量筛选 菌株261MY6在接种量

为14%时生物量(OD600)最大(P<0.05)(图9)，说明261MY6菌株生长最适的接种量为14%(图11)。

图10 温度对生防菌株261MY6生长的影响Fig.10 Effect of temperature on the growth of antagonistic strain 261MY6

图11 接种量对生防菌株261MY6生长的影响Fig.11 Effect of inoculum on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.4.4最佳装液量筛选 如图12，菌株261MY6在装液量为40 mL·(150 mL)-1时生物量(OD600)最大，且与其他装液量条件下的结果差异显著(P<0.05)，说明生防菌株261MY6的最佳装液量为40 mL·(150 mL)-1。

图12 装液量对生防菌株261MY6生长的影响Fig.12 Effect of different liquid volume on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.4.5最佳摇床转速筛选 如图13，菌株261MY6在摇床转速达到210 rpm时生物量(OD600)达到最大，且都显著高于其他转速时的生物量(P<0.05)，说明菌株261MY6生长最适的摇床转速为210 rpm。

图13 摇床转速对生防菌株261MY6生长的影响Fig.13 Effect of different rotate speed on the growth of antagonistic strain 261MY6

2.5 100 L发酵罐放罐时间确定

在筛选好的最佳摇瓶发酵条件的前提下对生防菌株进行100 L发酵罐扩大培养，并测定最佳的放罐时间，菌株261MY6延缓期较长，在21 h后进入对数期，到30 h时生物量达到最大值，且显著高于其他时段的生物量(OD600)(P<0.05)，之后直接进入衰退期。说明菌株261MY6的发酵罐最佳放罐时间为30 h (图14)。

图14 发酵时间对生防菌株261MY6生长的影响Fig.14 Effect of different fermentation time on the growth of antagonistic strain 261MY6

3 结论与讨论

解淀粉芽胞杆菌是芽胞杆菌属细菌[13]，它能够产生植物生长激素IAA、溶磷、固氮，刺激作物生长和诱导其防御系统产生抗性，同时分泌葡聚糖酶、几丁质酶、甜蛋白、类甜蛋白、抗生素肽类物质、伊枯草菌素、芬枯草菌素、表面活性素、芽胞素类和细菌素等抗菌活性物质[14]，从而达到预防植物病害和抑制植物病原菌的作用[15-16]。目前，解淀粉芽胞杆菌已成为科研工作者的研究热点，已有多种解淀粉芽胞杆菌菌株商品化。巴西Gertis Europe公司登记的解淀粉芽胞杆菌D747(Ecoshot)可防治柑橘杂色病毒(Phyllostictacitricarpa)、及多种作物的白粉病(Blumeriagraminisf.sp.tritici)、灰霉病(Botrytis.spp)以及茎腐病(F.graminearum)[17]；我国苏科农化公司登记解淀粉芽胞杆菌B1619和解淀粉芽孢杆菌Lx-11分别能够有效防治番茄枯萎病(Fusarium.oxysporum)和水稻细菌性条斑病(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola, Xooc)[18]。本试验解淀粉芽胞杆菌261MY6对马铃薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、马铃薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)、孜然根腐病菌(F.Solani)、黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、马铃薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)和番瓜根腐病菌(Fusariumsp.)等多种病原菌有良好的抑制作用，对开发生物农药有得天独厚的优势。

解淀粉芽胞杆菌作为生防制剂用来防治植物病害，生物学特性的探究和培养条件优化是制备生防制剂的重要手段，菌株生物学特性和培养基成分、溶氧量、pH、发酵时间以及摇床转速等多种因素对产品性能发挥和产品的制备储存均有较大的影响。研究发现解淀粉芽胞杆菌261MY6的生长最适温度范围为28～36℃，最低生长温度4℃，最高生长温度56℃，致死温度为95℃，最适pH值为5～7，该结果说明菌株在4～56℃范围内均能生长，且28～36℃的生长效果最佳，菌株适宜范围广；最适pH5～7，说明菌株适合在偏酸性的环境中生存。最优培养基配比牛肉膏3 g，乳糖25 g，MgSO43 g，酵母膏7 g，水1 000 mL；最佳生长条件：温度32℃，接种量14%，装液量40 mL·(150 mL)-1，摇床转速210 rpm，pH 7，100 L发酵罐放罐时间30 h。此结果与魏立娟[19]和卢彩鸽等[20]报道的解淀粉芽胞杆菌的优化结果较为相似，发酵时间比卢彩鸽等[20]报道的发酵时间缩短了五分之三，比于靓[21]等报道的培养温度37℃低且最佳时间36 h少6 h，说明解淀粉芽胞杆菌261MY6能在较短的时间内获得大量菌体，满足生产要求，与张涛等[22]报道的相比碳源、氮源和无机盐都不一样，这可能与菌生存环境有一定的关系；经过发酵工艺的优化，解淀粉芽胞杆菌261MY6的生物量提高了将近6倍(发酵前最高的OD600为1.48，发酵后的OD600为8.24)，且活菌数达2.37×1012CFU·mL-1，发酵后菌量明显比张荣胜等[23]和王法国等[24]报道的菌量高出许多。该结论为菌株261MY6进入工业化生产奠定了良好的基础。但本试验未对菌株261MY6的抑菌物质进行分离纯化和鉴定，此还有待于进一步研究。