抗疲劳保健品中非法添加那非类物质液质筛查方法建立

郁俊杰，杨 铖，金 凡，张靠山，吴国萍,2*

(1.江苏警官学院 刑事技术系，江苏 南京 210031；2.江苏省食品药品与环境犯罪技术检验工程实验室，江苏 南京 210031)

近年来，公安机关食药环侦部门对保健品中非法添加化学成分的打击一直处于高压态势，受到社会的广泛关注与好评。这类非法添加案件发案率极高，屡打不尽。公安部近几年所公布的典型案例分析，可以发现抗疲劳类保健品中基本都西地那非类药物的检出。2014年，浙江省食品药品监督管理部门会同公安机关查处了货值高达1.8亿的含西地那非成分的假性药。2017年警方查处网上销售“清宫御酒”的店铺，收缴该酒200余瓶，从其中检测出违法添加的西地那非等化学物质。本文拟建立常见的那非类物质高分辨质谱的快速筛查方法，讨论最佳液质检测条件，通过保留时间及特征离子峰以及相对丰度对非法添加物进行快速筛查。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Tripe QTOF 5600+ 液质联用仪(超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用)；电子分析天平型号ME104；

那红地那非、伪伐地那非、那莫西地那非、红地那非、西地那非、豪莫西地那非、爱地那非、硫代爱地那非、羟基豪莫西地那非9种标样购于中国食品药品检定研究院，分别精密称取上述标准品0.01 g于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容为1 mg/mL的储备液，冷藏避光贮存，临用时稀释备用。

22种保健品来源于某市公安局食药环侦部门缴获，如表3所示；称取保健品0.1 g，甲醇定容至10 mL，5000 r/min离心5 min，上清液经微孔滤膜过滤(0.22 μm，有机相)，取滤液稀释100倍作为储备液，供LC-MS/MS 分析。冷藏保存备用。

1.2 液质联用仪条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0×100 mm，1.8 μm)；流动相：A：5 mmol·L-1醋酸铵-0.1%甲酸缓冲溶液，B：乙腈；进样量为5μL，梯度洗脱程序，见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱条件

电离方式：电喷雾正(负)离子模式。离子源参数：雾化气压力(GS1)50psi，辅助加热气(GS2)50psi，气帘气(CUR)35psi，干燥气温度：500℃，离子化电压：正离子模式5500 V。一级质谱条件：去簇电压(DP)：80 V，碰撞能量(CE)：10 V。二级质谱条件：碰撞能量(CE)：25～35 V；碰撞能量范围(CES)：15～20 V。

2 结果与讨论

2.1 溶剂和流动相的选取

那非类物质是非极性的有机化合物，不溶于水，易溶于有机溶剂。正离子模式下流动相的酸度对出峰时间和检测灵敏度会产生影响。在有机相选择乙腈作为流动相B的前提下，改变流动相A乙酸铵溶液的酸度，结果发现：不同pH值时，各待测组分的保留时间、出峰顺序以及灵敏度均有所不同。经分析讨论，笔者认为这与待测组分中的碱性分子结构有关。综合比较，本次实验选用当0.1%甲酸-5 mmol·L-1乙酸铵溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B。在这种情况下，出现的色谱峰的呈现出峰形更尖锐，灵敏度更高等特点，满足分析和检测的要求。

2.2 西地那非等9种抗疲劳类药物对照品液质筛查方法

将标准品配成100 ng·mL-1单针进样，经过液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱解析，得到各标准品质谱图和提取离子流图，如图1～9所示。分析图1～9，得这9种那非类物质的主要质谱参数如表2所示。

图1 那红地那非的二级质谱图

图2 伪伐地那非的二级质谱图

图3 那莫西地那非的二级质谱图

图4 红地那非的二级质谱图

图5 西地那非的二级质谱图

图6 豪莫西地那非的二级质谱图

图7 爱地那非的二级质谱图

图8 硫代爱地那非的二级质谱图

图9 羟基豪莫西地那非的二级质谱图

由图中可见，那非类各物质的分子离子峰十分明显，但与分子离子峰相比之下，主要碎片离子峰的相对丰度显现得不是很明显。将西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、硫代艾地那非、伪伐地那非、那莫西地那非、红地那非、那红地那非、枸橼酸艾地那非配成1 μg·mL-1混合标准液进样，通过对结果的讨论，可发现西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、硫代艾地那非、红地那非、那红地那非、枸橼酸艾地那非都能够被很好的分离出来，伪伐地那非、那莫西地那非是同分异构体，特征碎片离子也相同，不能够进行有效地区分。

表2 那非类物质的主要质谱参数

2.3 破碎电压对裂解程度的影响

以西地那非为例，研究破碎电压对碎片离子相对丰度的影响。西地那非的母离子m/z为475，主要碎片离子为 m/z 377、311、283，由其结构所推出，在外界电压的影响下，西地那非分子上的酰基 N-S 键首先发生断裂，得到的碎片离子为m/z 377 。紧接着在m/z377碎片离子上发生断裂的是C-S键，得到碎片离子m/z 311。再之后裂解脱去C2H4烷基自由基碎片，得到碎片离子m/z 283。认为CE=35 V时，m/z311、m/z283碎片离子峰相对于分子离子峰显得过小，是由于破碎电压太小，导致试剂在经过电离源时并没有被充分电离成碎片离子。考虑到仪器的承受能力，将破碎电压(CE值)分别调至40 V和50 V，再次进样，得到新的质谱图和提取离子流图，与破碎电压(CE值)为35 V时并列比较。通过质谱图图10～12，我们能清晰地看出，破碎电压越大，西地那非分子的电离效果越好，特征碎片离子越多。考虑到Triple QTOF 5600+ 液质联用仪的承受能力，以CE=50 V时，效果最明显。 西地那非的裂解程度与仪器的破碎电压有关。在本仪器的承受范围以内，以CE值分别为35 V±20 V、40 V±20 V、50 V±20 V的时候进样，其中CE值为50 V时，西地那非分子裂解效果最好。

2.4 市售22种抗疲劳保健品中非法添加物检验

图10 CE=35 V时西地那非质谱图与提取离子流图

图11 CE=40 V时西地那非质谱图

图12 CE=50 V时西地那非质谱图

22种市售保健品配成1 μg·mL-1甲醇溶液，其中样品“一想就硬”有黄色和绿色两类药片，将其编为两个样品，分别研磨溶解并编号，共计22个样品溶液，单针进样，同时进样标准品，作为参照。通过综合比较分析保健品溶液中物质的分子离子峰(m/z475)、特征碎片离子峰(m/z311、m/z283)、保留时间(8.40min)以及相对丰度，结果发现，这22个进样溶液中，有20个溶液里检测出西地那非。也就是说市售22种保健品里，检测出西地那非的有20种。其质谱图如图10～12所示。其保留时间整理如表3所示。

表3 22种市售保健品的非法添加情况

表3(续)

3 结论

本文运用Triple QTOF 5600+ 液质联用仪建立了同时测定西地那非、硫代艾地那非、爱地那非、伪伐地那非、那莫西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、红地那非、那红地那非9种常见的那非类非法添加物的液质筛查方法；并对22种保健品中进行那非类非法添加的筛查，认定有19种保健品中含有西地那非，1种含羟基豪莫西地那非。实验简单易行，操作方便，结论准确，便于食品保健品中非法添加违禁品案件检测需求。