艾地苯醌抑制氧化应激所致皮层神经细胞凋亡的机制

高 玲 唐 红

(长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031)

线粒体功能受损是神经退行性疾病的发病机制之一，例如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化(AKS)〔1〕等。氧化应激是伴有线粒体功能障碍的一个早期事件。在ATP的产生过程中，高能量的电子传递是一个必需步骤，但它同时也是活性氧(ROS)产生的来源〔2〕。ROS的积聚能损坏一些生物分子，包括脂类、蛋白质和核酸，从而产生细胞毒性〔3〕。艾地苯醌是一种新型的脑代谢及精神症状改善剂，在结构上类似辅酶Q10，具有良好的抗氧化活性〔4〕。动物实验表明，艾地苯醌的抗氧化活性大约是辅酶Q10的100倍，而且还可以通过血脑屏障进入脑内。p53是细胞凋亡的启动因子之一，是细胞信号转导通路的重要的中介枢纽分子。当细胞处于应激状态下p53可以通过阻止细胞进入细胞周期而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3是p53重要的下游基因。研究表明〔5〕，p53在AD动物模型和细胞模型中明显升高，这与神经元的凋亡有直接关系。艾地苯醌在许多神经退行性疾病中表现出的神经保护和治疗作用是否通过降低p53蛋白表达而发挥对线粒体的保护作用还不清楚。本文探讨艾地苯醌抑制氧化应激所致皮层神经细胞凋亡的机制。

1 材料和方法

1.1试剂与药品 p53蛋白单克隆抗体、caspase3单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)、多聚赖氨酸、艾地苯醌(Sigma公司，美国)，DMEM(Gibco公司，美国)，胎牛血清及马血清(Hyclone公司，美国)，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1原代大鼠脑皮质神经细胞培养 参照文献〔6〕的方法略加改动。取孕17～19 d的SD大鼠(来自吉林大学动物部)的胎鼠，于无菌条件下取出大脑皮层去除血管和软脑膜后剪碎成0.5 mm3，用D-Hank液洗2遍，置于0.25%胰蛋白酶中消化，37℃孵育15 min，加入10%胎牛血清终止胰酶消化，离心去上清。加入10%胎牛血清与5%马血清的接种培养液，吸管吹打分散细胞，制备单细胞悬液，尼龙网过滤，计数，调细胞浓度为1×106细胞/ml接种于铺有多聚赖氨酸的培养板内，48 h后全量换液。72 h后将培养液中加入阿糖胞苷(10 μg/ml)以抑制非神经细胞增殖。24 h后半量换液。以后每3 d半量换液1次，培养到7～10 d细胞用于实验。

1.2.2神经细胞损伤实验 取培养好的神经细胞，每8孔为1组，过氧化氢(H2O2)共分5组，浓度分别为0.0、0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L；绘制量效关系曲线，选择适当浓度进行后续实验。

1.2.3细胞生存力测定 采用MTT法进行。细胞培养至所需天数时，经H2O2等处理后的细胞(每组8孔)，每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT液，于37℃孵箱孵育4 h，取出，弃去培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，微量混匀器充分混匀，酶标仪570 nm处读取吸光度(A)值。

1.2.4LDH释放率测定 用LDH释放率来反映细胞损伤程度，按试剂盒的说明书操作。实验中用不同浓度的艾地苯醌(1，5，10，20，50 μmol/L)预处理皮层神经细胞2 h，然后分别加入0.5 mmol/L H2O2，6 h后测定细胞LDH释放率。培养细胞每8孔为1组。

1.2.5Western印迹检测p53蛋白、caspase3蛋白表达 细胞被裂解后，二甲基喹啉酸(BCA)法检测蛋白质浓度。电泳时每个样品上样20 μg，蛋白质经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用TBST溶液洗膜3次，封闭液封闭非特异性结合位点后，PVDF膜孵育在抗p53单克隆抗体(1∶1 000)，抗caspase3单克隆抗体(1∶1 000)中常温下过夜，用TBST溶液反复清洗后在二抗溶液中室温下孵育2 h，并在电化学发光(ECL)检测系统中检测目标蛋白条带。

1.3统计学方法 用Prism软件进行双因子方差分析。

2 结 果

2.1H2O2诱导的浓度和时间依赖性细胞死亡 0.1，0.3，0.5，0.7 mmol/L的H2O2作用于原代培养的鼠皮层神经细胞24 h后，细胞死亡率随H2O2浓度增加而增大(各组细胞吸光度值分别为0.65±0.04、0.56±0.04、0.48±0.05、0.29±0.04)，0.5 mmol/L和0.7 mmol/L H2O2明显降低细胞的生存率，与正常对照组(0.78±0.04)比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明H2O2可引起浓度依赖性细胞死亡。后续实验选用0.5 mmol/L H2O2作用于培养3、6、24 h后的皮层神经细胞，结果显示随培养时间的延长细胞死亡率增加(各时点细胞吸光度值分别为0.70±0.07，0.63±0.04，0.48±0.05)，作用于24 h后细胞的死亡率可达50%以上，说明H2O2可引起时间依赖性细胞死亡。

2.2艾地苯醌抑制H2O2诱导的细胞死亡 皮层神经细胞经0.5 mmol/L H2O2培养6 h后，LDH释放率可达85%以上〔(85.16±5.64)%〕，与正常对照组比较差异有统计学意义〔(27.96±4.67)%,P<0.01〕，而提前应用艾地苯醌2 h可以有效降低H2O2诱导的细胞死亡〔1,5,10,20,50 μmol/L艾地苯醌组LDH释放率分别(63.55±7.36)%、(55.98±6.25)%、(44.69±4.22)%、(67.64±4.57)%、(75.96±3.50)%〕，最后以10 μmol/L的艾地苯醌效果最明显(P<0.01)，说明艾地苯醌可以完全逆转H2O2引起的细胞死亡。

2.3各组p53和caspase3蛋白表达水平 0.5 mmol/L H2O2处理6 h后升高的p53和caspase3蛋白水平可被艾地苯醌所抑制(图1)，说明艾地苯醌通过抑制p53蛋白的表达而降低神经细胞的凋亡率。

1～6：对照组、1，5，10，20，50 μmol/L艾地苯醌组图1 各组p53和caspase3蛋白表达

3 讨 论

1986年，日本的Takeda公司首先在临床上应用艾地苯醌治疗与情绪紊乱相关的心血管病。在原代培养的皮层神经元模型中，艾地苯醌可通过增强细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽活性而使细胞不死来减弱氧化损伤。14C放射标记实验证明，口服艾地苯醌可通过血脑屏障。艾地苯醌可以保护由2-氨基-3羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)引起的神经细胞损伤。艾地苯醌在许多不同的国家已作为临时实验用药或已被批准用于临床用药。因它具有优越的生物利用率和安全性，使它成为有吸引力的神经退行性疾病治疗药物的候选。在临床实验中，艾地苯醌提高AD患者记忆力和注意力并提高患者的行为能力，但不能减缓AD的认知功能衰退〔7〕。而且艾地苯醌的剂量大于25 μmol/L时具有神经毒性〔8，9〕。这一点也与本实验结果相吻合。p53蛋白被激活，从而启动程序细胞死亡，最终导致细胞凋亡。本研究表明艾地苯醌预处理组可降低p53蛋白的表达，降低细胞凋亡率，caspase3蛋白表达水平变化不明显，说明艾地苯醌的抗氧化应激损伤是通过降低p53蛋白的表达水平实现的。

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8Senin U，Parnetti L，Barbagallo-Sangiorgi G，etal.Idebenone in senile dementia of Alzheimer type: a multicentre study〔J〕.Arch Gerontol Geriatr，1992;15(3):249-60.

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