膀胱癌组织和细胞中DKK2表达变化及意义

王银蕾，王爱香，王玉杰，沈冲，田大伟，胡海龙

(天津医科大学第二医院，天津300201)

美国2016年诊断膀胱癌74 690例，死亡15 580例[1]。在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中膀胱癌的发病率和病死率均居首位，且呈逐年上升趋势。大约90%以上膀胱癌为尿路上皮癌(BUC)，其中大部分为非肌浸润型BUC(占80%)，经尿道局部切除效果较好；另一类为肌浸润型BUC(占20%)，一般行根治性膀胱切除术同时盆腔淋巴结清扫，但约50%肌浸润型BUC发生转移[2]。故阐明BUC发病的分子机制，找出与其发生发展密切相关的关键基因，是优选高效特异性治疗靶点、优化关键技术、改进治疗模式及探索膀胱癌个体化基因治疗新策略的关键。Dickkopf相关蛋白2(DKK2)是一组分泌型糖蛋白，包括DKK1、DKK2、DKK3、DKK4。人DKK基因位于染色体10q11上，由225～350个氨基酸组成，相对分子质量约38 kD。DKK由2个富含半胱氨酸的保守区域及与之连接的不等长区域构成[3]。研究显示，DKK2在淋巴转移的膀胱癌组织中高表达，可促进膀胱癌迁移和侵袭[4]，可见DKK2与膀胱癌的发生发展有密切关系。本研究探讨膀胱癌组织和细胞中Dickkopf相关蛋白2(DKK2)的表达变化及临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2008年9月～2018年9月本院收治的原发性膀胱癌患者40例，均经病理检查确诊，术中采集膀胱癌组织和癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 cm)标本。患者男32例、女8例，年龄<60岁11例、≥60岁29例，有吸烟史19例，肿瘤直径<3 cm 21例、≥3 cm 19例，肿瘤单发24例、多发16例，病理分级[5]为低级别18例、高级别22例，T分期为Ta～T1期28例、T2～T4期12例，非肌浸润型BUC 28例、肌浸润型BUC 12例。患者均签署书面知情同意书，研究已获天津医科大学机构审查委员会批准。

1.2 细胞培养 选择永生化膀胱上皮细胞SV-HUC-1及膀胱癌上皮细胞系EJ、HTB-9(5637)、T24(天津医科大学第二医院中心试验室)、253-JBV(由西安交通大学第一附属医院泌尿外科李磊教授提供)。细胞均于含10%胎牛血清青霉素-链霉素双抗、RPMI1640培养基(Gibico)的细胞培养瓶中培养，并于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。细胞生长至对数期用于实验。

1.3 膀胱癌组织差异表达基因筛选方法 分析癌症和肿瘤基因图谱数据库(TCGA)、高通量基因表达数据库(GEO)，对膀胱癌及正常膀胱标本的RNA-Seq数据进行处理和基因注释，筛选与预后相关的目标基因。基于预后相关的目标基因构建共表达网络图，GO富集分析靶基因参与的生物学过程。

1.4 膀胱癌组织与癌旁正常上皮黏膜组织中DKK2蛋白表达检测 采用免疫组化法。切取石蜡切片(5 μm厚)，将切片放于42 ℃水浴锅中使组织充分展开，载玻片45°角入水将组织平铺，在75 ℃恒温烤箱里烤片1 h，依次经过组织切片脱蜡，抗原修复，一抗和二抗孵育。细胞核复染，组织脱水，封片，并在显微镜下观察。由天津医科大学第二医院泌尿研究所病理科2名医生分别阅片。用Image J处理图片。测定DKK2表达区域灰度值，通过半定量方法测算DKK2蛋白的相对表达量，计算平均值，高于平均值为蛋白高表达，低于或等于平均值为蛋白低表达。

1.5 永生化膀胱上皮细胞与膀胱癌细胞中DKK2基因表达检测 采用qRT-PCR技术。用TRIzol法提取细胞RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DKK2正向引物序列：5′-CGACACACCATGCAGGCCGA-3′、反向引物序列：5′-CCTGGTCAGGCCGCCAATCG-3′[6]；内参为β-actin，正向引物序列：5′-GTGTTGCCCCTGAAGAGCAT-3′、反向引物序列：5′-GCTGGGACATTGAAAGTCTCA-3′。PCR扩增参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。用荧光定量PCR仪(ABI7900)自动计算Ct值，用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。每种细胞设三个复孔，计算平均值。

2 结果

2.1 膀胱癌组织差异表达基因验证 共选择GEO数据库中3个数据集GSE3167、GSE7476、GSE55433，筛选出29个目标基因。基于预后相关的目标基因构建共表达网络图，GO富集分析这些靶基因参与的生物学过程，发现DKK2正是待验证候选基因之一。

2.2 膀胱癌组织与癌旁正常组织中DKK2蛋白表达比较 膀胱癌组织中DKK2蛋白高表达22例，癌旁正常组织DKK2蛋白均呈低表达，二者比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 膀胱癌组织中DKK2蛋白表达与患者临床病理参数的关系 DKK2蛋白表达与患者性别、年龄、吸烟、肿瘤数量无关(P均>0.05)，与肿瘤直径、病理分级、T分期有关(P均<0.05)。见表1。

表1 膀胱癌组织中DKK2蛋白表达与患者临床病理参数的关系(例)

2.4 永生化膀胱上皮细胞与膀胱癌细胞中DKK2基因表达比较 SV-HUC-1、EJ、HTB-9、T24、253-JBV细胞中DKK2基因相对表达量分别为1、5.13±0.26、43.71±1.12、72.25±2.50、98.83±3.26。与SV-HUC-1细胞比较，EJ、HTB-9、T24、253-JBV细胞中DKK2基因相对表达量高(P均<0.05)。T24、253-JBV细胞中DKK2基因相对表达量高于EJ、5637细胞，253-JBV细胞中DKK2基因相对表达量最高(P均<0.05)。

3 讨论

膀胱癌诊断的金标准是病理活检，但该方法有创、费时且花费高，寻找类似前列腺癌特异性抗原的膀胱肿瘤特异性标记物是目前研究热点[7]。目前TCGA、GEO等数据库囊括人类全基因组测序、多物种基因测序、基因芯片测序结果。根据癌组织芯片高通量测序结果可分析出可信的预测标记物。本研究依靠TCGA和GEO检索，寻找膀胱癌的特异性预测标记物，得出DKK2在膀胱癌组织中高表达并扮演促进肿瘤进展的角色。本研究首次以DKK家族基因为指标，立足于DKK2蛋白本身结构特点，通过收集临床膀胱癌患者癌组织和癌旁正常组织，明确膀胱癌组织中存在DKK2差异表达，能够成为潜在癌症预测因子和治疗靶点；另外在体外细胞实验中，明确DKK2表达与癌细胞恶性程度相关。

迄今为止的报道多有关DKK2与癌症发生发展的关系及机制。如研究[8]结果显示，在结直肠癌组织中，DKK2可能通过拮抗Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路发挥作用。研究发现，DKK2在前列腺癌组织和细胞中表达上调，敲除DKK2基因抑制了癌细胞的增殖和侵袭；此外，靶向DKK2的小干扰RNA抑制前列腺癌细胞中β-catenin、周期蛋白D1和细胞周期蛋白的表达[9]。目前，DKK2基因在人膀胱癌组织中的作用及相关机制尚不清楚。DKK2基因在多种肿瘤组织中差异表达，在膀胱癌组织中差异表达显著[10]。本研究发现，DKK2蛋白在膀胱癌组织中高表达，DKK2蛋白表达与膀胱肿瘤大小、病理分级及T分期有关，说明DKK2参与肿瘤增殖与侵袭过程；同时，临床治疗方案的制订多参照膀胱癌临床分期、病理分级、肿瘤数目等指标[11]，根据本研究结果，DKK2同样能成为诊治的参考指标，且无创。进一步研究发现，DKK2蛋白表达定位于细胞膜、胞质。在4种膀胱癌细胞EJ、HTB-9、T24、253-JBV中DKK2基因表达高于永生化细胞SV-HUC-1；且在恶性度最高的253-JBV细胞中，DKK2基因表达最高，DKK2高表达能预测肿瘤的恶性度。

总之，本研究证实DKK2在膀胱癌组织及癌细胞中高表达，其表达与膀胱肿瘤直径、病理分级及T分期有关。目前膀胱癌的预测指标较多，但能用于临床检测的很少，本研究为临床提供了一项检测指标。但本研究缺少临床大样本，并且对基因在癌症进展中作用的研究不够深入。下一步计划扩大样本，同时建立细胞模型，以进一步深入研究。