GPC3抗原表位肽致敏树突状细胞对T淋巴细胞活化的影响

高敦芹，骆莹，王鹏，景丽，高英堂

(1天津医科大学三中心临床学院，天津300170；2天津市人工细胞重点实验室·天津市第三中心医院；3天津市肝胆疾病研究所)

肝细胞癌(HCC)是肝脏最常见的原发肿瘤，是全球癌症相关死亡的第三大原因[1]。目前手术、放疗和化疗仍是控制癌症的三大常规方法，但对于晚期癌症患者的治疗和预防复发转移效果仍不理想[2]，而且HCC对传统的治疗方法不敏感。程序性细胞死亡(PD-1)及其配体(PD-L1)抑制剂、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)等新型免疫疗法在肿瘤治疗中不断取得突破性进展[3]。但PD-1/PD-L1抑制剂易引起免疫介导的肺炎和免疫性心肌炎[4]，CAR-T疗法产生脱靶效应[5]和细胞因子释放综合征[6]等。而且HCC缺乏有效的治疗靶点，以上治疗方法处于临床研究阶段。近年来利用肿瘤表面抗原的特异性免疫疗法得到临床关注，用抗原表位肽致敏树突状细胞(DC)进而活化T淋巴细胞，在该过程中肿瘤特异性抗原的筛选至关重要[7]。因此选择有效的肿瘤特异性抗原，提高T淋巴细胞的肿瘤杀伤特异性，是当今HCC免疫疗法需要解决的主要问题。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)可介导Wnt通路活化，在细胞生长发育中起重要的调控作用[8]。研究发现，GPC3在正常组织器官中几乎不表达，而在HCC组织中的表达比周围非癌组织高80%，可作为HCC理想的分子诊断标志物和免疫治疗的候选靶标[9]。基于质谱及文献数据分析，选择GPC3144-152和GPC3298-306两种抗原表位肽，二者均为人类白细胞抗原A2(HLA-A2)限制性抗原表位肽，且已验证不会产生自身免疫[10]。2017年12月～2018年8月，本研究通过GPC3144-152和GPC3298-306抗原表位肽负载DC并诱导产生针对GPC3特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，通过对CTL中淋巴细胞亚群、Th细胞极化及表面趋化因子(CCR6、CXCR3、CXCR4、CCR4、CCR5)变化的评估，明确GPC3抗原表位肽对T细胞的活化作用，为其进一步临床个体化治疗HCC提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 胎盘端脐带血(50 mL)由20例天津市第三中心医院HLA-A2阳性健康足月剖宫产产妇提供。肝癌细胞株HepG2由天津市第三中心医院保存。本研究获得天津市第三中心医院伦理学会批准，研究对象均签订知情同意书。ALyS505N培养基(日本细胞科学研究所株式会社)，淋巴细胞分离液(天津美德太平洋科技有限公司)；PBS缓冲液(日本Takara公司)，CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PECY5、CXCR4-APC、CCR5-APC、CCR4-PE-CY7、CCR6-PE-CY7、CXCR3-PE-CY7、CD83荧光抗体、CD86荧光抗体(美国BD公司)，同型对照荧光抗体、小鼠抗人CD3单抗(CD3mAb)(美国eBioscience公司)；相差显微镜(日本Olympus公司)，流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)。

1.2 GPC3抗原表位肽及肿瘤细胞冻融抗原的制备 HLA-A2限制性GPC3特异性表位144和298表位肽由上海吉尔生化有限公司合成，采用反相高压液相色谱仪(RP-HPLC)鉴定其纯度达95%以上，抗原肽序列为GPC3144-152(FVGEFFTDV)、GPC3298-306(EYILSLEEL)。取HepG2细胞1×107个，用无菌水重悬，置于-80 ℃冰箱中20 min，于37 ℃水浴中缓慢融化，重复4次，离心去除碎片，取上清，测定总蛋白，用于肿瘤细胞冻融抗原的制备。

1.3 DC的分离、培养及活化 将采集的抗凝脐带血，800 g/min离心8 min，吸取血清与红细胞之间部分，PBS稀释至40 mL，缓慢加入淋巴细胞分离液中，500 g/min离心30 min，使其分层，吸取白膜层细胞，无菌PBS洗涤后RPMI-1640完全培养液重悬，并调整细胞密度为2×107/mL，置37 ℃、5% CO2条件下培养60～90 min，培养液中的悬浮细胞为T细胞，收集并用于后续培养；贴壁细胞即为DC，加入含有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF,100 ng/mL)、白细胞介素4(IL-4,500 U/mL)的RPMI-1640培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，并于贴壁培养2 h及5 d时在Olympus电子显微镜(Tokyo，Japan)下观察细胞形态，并采集图片。取培养第5天的DC进行活化，将DC随机分组，DC-GPC3144-152组(GPC3144-152表位抗原肽负载DC)、DC-GPC3298-306(GPC3298-306表位抗原肽负载DC)、DC-HepG2组(冻融HepG2细胞抗原负载DC)、DC组(无抗原负载DC)，分别加入50 ng/mL GPC3144-152抗原表位肽10 μL、50 ng/mL GPC3298-306抗原表位肽10 μL、100 μg/mL HepG2细胞冻融抗原10 μL，均加入10 ng/mL肿瘤坏死因子α(TNF-α)4 μL，培养2 d，观察其细胞形态并拍照，收集细胞，用流式细胞术检测其表型。

1.4 DC细胞表型检测 采用流式细胞术。取各组培养的DC细胞，300 g/min离心5 min，弃上清。将细胞平均分装到多个流式检测管中(每管细胞不少于106)，分别加入20 μL/管荧光抗体CD80(FITC)、CD83(FITC)、CD86(FITC)，室温避光孵育0.5 h。PBS洗涤，离心后弃上清，细胞溶于500 μL PBS中，吹打混匀，用流式细胞术进行检测，同型作为对照。

1.5 T细胞的分离培养及其与DC细胞的共培养 用CD3 mAb(5 μg/ mL)提前24 h包被培养瓶，将脐带血中分离出的悬浮细胞离心，应用ALyS505N培养基，添加700 U/mL IL-2 100 μL、5%自体血浆200 μL，诱导3 d后转入另一培养瓶，隔天添加培养基，培养液中只加入IL-2(100 U/mL)15 μL及1%自体血浆40 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养。将培养成熟且负载抗原后的DC与T细胞以1∶10比例混合，ALyS505N培养基100 mL重悬细胞，再加入200 U/mL IL-2，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱连续培养7 d，得到不同致敏方式DC活化的T细胞(DC-GPC3144-152-T组、DC-GPC3298-306-T组、DC-HepG2-T组、DC-T组)，以未经活化的T细胞作对照(T细胞组)。收集细胞，用流式细胞术进行细胞分类及表面趋化因子检测。

1.6 T细胞分类及表面趋化因子受体(CCR6、CXCR3、CXCR4、CCR4、CCR5)检测 采用流式细胞术。取各组培养的DC-T细胞，300 g/min离心5 min，弃上清。将细胞平均分装到多个流式检测管中(每管细胞不少于106)，分别加入20 μL/管荧光抗体CD4/CD8/CD3(FITC/PE/PECY5)、CCR6(PE-CY7)、CXCR3(PE-CY7)、CXCR4(APC)、CCR4(PE-CY7)、CCR5(APC)，室温避光孵育0.5 h。PBS洗涤，离心后弃上清，细胞溶于PBS 500 μL中，吹打混匀后，上机检测。

2 结果

2.1 DC经不同致敏方式活化后的形态学变化 倒置相差显微镜下观察培养DC形态，贴壁后2 h，可见细胞均匀散在分布、不形成集落；在起始的2～3 d，DC仍呈贴壁状态生长，呈小集落生长；4～5 d，贴壁细胞体积增大，部分细胞周围可见伪足，少许细胞由贴壁转为悬浮且呈簇状生长。第5天加入GPC3144-152表位抗原肽、GPC3298-306抗原表位肽、HepG2细胞冻融抗原及TNF-α后，各组间细胞形态无明显区别，细胞成簇悬浮生长，可观察到胞体增大，且表面有大量伪足突起，呈典型DC形态。GPC3144-152和GPC3298-306表位抗原肽均能诱导出具有典型形态的DC。

2.2 不同致敏方式对DC表面抗原的影响 DC-GPC3144-152组、DC-GPC3298-306组DC表面能够表达CD80、CD86和CD83抗原，与其他各组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.3 GPC3抗原表位肽致敏DC对T淋巴细胞亚群的影响 与T细胞组比较，其余四组中CD8+T淋巴细胞比例高(P均<0.05)，CD4+T淋巴细胞比例低(P均<0.05)；DC-T组、DC-HepG2-T组、DC-GPC3144-152-T组、DC-GPC3298-306-T组CD8+T、CD4+T淋巴细胞比例比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表1 不同致敏方式DC表面抗原表达比较

表2 不同致敏方式DC诱导T淋巴细胞亚群的变化

注：与T细胞组比较，*P<0.05。

2.4 GPC3抗原表位肽致敏DC对Th细胞极化的影响 与T细胞组比较，DC-GPC3298-306-T组、DC-GPC3144-152-T组中Th1细胞比例高(P均<0.05)，Th2细胞比例低(P均<0.05)；DC-GPC3298-306-T组Th1细胞比例高于DC-T组、DC-HepG2-T组(P均<0.05)，Th2细胞比例低于DC-T组、DC-HepG2-T组(P均<0.05)；DC-GPC3144-152-T组Th1、Th2细胞比例与DC-T组、DC-HepG2-T组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 不同致敏方式DC诱导Th细胞极化的影响

注：与T细胞组比较，*P<0.05；与DC-GPC3298-306-T组比较，#P<0.05。

2.5 GPC3抗原表位肽致敏DC对T细胞表面趋化因子的影响 与T细胞组比较，其余四组CCR6、CXCR3表达高(P均<0.05)；与DC-T组比较，DC-GPC3144-152-T组、DC-GPC3298-306-T组、DC-HepG2-T组CCR6表达高(P均<0.05)。见表4。

3 讨论

免疫疗法逐渐成为肿瘤的新型治疗方式，如免疫检查点PD-1/PD-L1抑制剂和CAR-T疗法等，在各类肿瘤如黑色素瘤和血液疾病等的治疗中不断取得进展[11]。然而也发现免疫疗法存在自身免疫系统紊乱等不良反应[12]，且其在HCC中缺乏有效的免疫治疗靶标。针对HCC的特异性表面抗原的免疫疗法，通过HCC特异性抗原表位肽致敏DC进而活化T细胞杀伤肿瘤细胞。目前该疗法常用全肿瘤组织反复冻融取抗原，但由于组织混杂，抗原成分不确定，易引起过敏反应。因此，选择一种更为有效且特异性强的肿瘤抗原标志物是迫切需要解决的问题。

表4 不同致敏方式DC对T细胞趋化因子的影响

注：与T组比较，*P<0.05；与DC-T组比较，#P<0.05。

GPC3具有显著的组织特异性，而且在HCC研究中发现GPC3的阳性表达率明显高于甲胎蛋白，可作为新的肿瘤标志物，有望成为免疫治疗的新靶点[13]。有研究在小鼠体内发现，GPC3表位肽可诱导出特异性的抗肿瘤免疫，而不引起自身正常组织的免疫性破坏[14]。总之，GPC3可作为HCC的一种新型特异性抗原用于致敏DC，应用GPC3致敏的DC活化产生特异性T细胞，将具有更强更特异的杀伤能力，有望成为HCC免疫治疗的新武器。

DC是主要的抗原递呈细胞，本研究采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(PBMC)，贴壁后，加入rhGM-CSF和IL-4诱导培养，加入GPC3表位抗原肽或肿瘤冻融抗原负载，加入TNF-α促进分化成熟，最后得到诱导成熟的DC。结果发现，不同的致敏方式均能使DC成熟活化，激活T淋巴细胞。T淋巴细胞的激活需要两个信号，一个是抗原信号,由T细胞表面的TCR有效结合抗原递呈细胞表面的MHC递呈抗原肽；另一个信号是共刺激分子信号，活化静息的T淋巴细胞成为效应性T淋巴细胞，如CTL。CTL活化后再循环至肿瘤组织，特异性杀灭肿瘤细胞[15]。本研究发现，负载GPC3144-152和GPC3298-306表位抗原肽的DC均能使T淋巴细胞亚群中的CD8+T细胞比例升高。提示负载GPC3表位抗原肽的DC与淋巴细胞混合培养后，能够激活产生GPC3抗原特异性的CTL。

最初研究认为，在CD4+Th细胞激活过程中，主要受周围细胞因子的影响，决定其向Th1或Th2极化。而后，研究发现DC在Th细胞向Th1或Th2分化过程中起到了重要作用。DC不仅能够提供驱动T淋巴细胞克隆扩增的一系列信号，同时还提供了Th细胞向Th1或Th2细胞分化的选择信号[16]。本研究发现，负载GPC3298-306表位抗原肽能够显著增加Th1细胞的比例。提示GPC3298-306表位肽负载的DC能够特异性地使Th0向Th1分化。

免疫细胞定向迁移至肿瘤组织是机体发生和完成免疫应答的必要条件，而其中趋化因子及其受体的作用是至关重要的因素。最近研究表明，肿瘤组织趋化因子及其受体的相互作用与HCC的致癌过程、发展及预后中密切相关[17]。CCR6表达于T细胞中的记忆性T细胞，CCL20是触发激动CCR6的趋化因子，主要分布于肝脏组织，其主要作用是趋化表达CCR6的淋巴细胞达到目标组织。本研究发现，经过DC诱导后，T细胞表达CCR6的比例上调，说明与DC共培养能够促进T细胞向肝脏或其他表达CCL20的组织聚集，且抗原负载后的DC(HepG2冻融抗原及GPC3抗原表位肽组)诱导的T淋巴细胞CCR6的表达更高。CXCR3主要在活化的CD8+T细胞和Th1细胞中表达，经过DC诱导后，T淋巴细胞表达CXCR3的比例上调，说明与T细胞单独培养比较，与DC共培养后T细胞活化比例显著升高。

GPC3144-152和GPC3298-306表位抗原肽均能够有效致敏DC，并活化共培养中T淋巴细胞。GPC3表位抗原肽致敏后的DC能够使共培养的T细胞亚群中的CD8+T细胞比例升高，提高CCR6、CXCR3的表达；且GPC3298-306表位抗原肽致敏的DC能够特异性使Th0向Th1极化。本研究为GPC3表位抗原肽致敏的DC诱导T细胞应用于肿瘤免疫治疗提供了体外实验基础，但还应进行动物体内实验为临床应用提供依据。