鞘内保残重建术与牵张保残重建术对兔前交叉韧带残端成纤维细胞增殖、凋亡的影响

舒莉，柴浩，巨啸晨，张磊

(1新疆医科大学第六附属医院，乌鲁木齐830002；2武警兵团总队医院)

前交叉韧带(ACL)损伤临床发病率高，是骨科常见病。2009年美国普通人群ACL损伤率为35/100 000[1]，运动员高达60/100 000。我国虽无具体统计数据，但随着运动事业和交通业的发展，ACL损伤发病率正逐年提高。ACL断裂后胫骨残端常长期粘连在后交叉韧带上。有研究认为，残端内残存的成纤维细胞能够加速移植腱的韧带化[2]，因而保留残端(保残)重建ACL成为近年运动医学研究的热点。目前临床常用的保残重建ACL的术式主要为"残端鞘内重建"与"牵张保残重建"，然而这两种保残重建ACL的术式是否存在疗效差异，国内外鲜见报道。2017年12月～2018年6月，本研究建立了残端鞘内保残重建ACL、牵张保残重建ACL动物模型，观察两种不同保残重建术对ACL残端内成纤维细胞增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 雄性新西兰大白兔43只，体质量3.0～3.5 kg，由新疆医科大学动物实验中心提供，普通级、封闭群。舒泰(法国维克公司)，速眠新Ⅱ(吉林圣达动物药品有限公司)，增殖细胞相关核抗原(Ki-67)试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，全自动轮转式切片机、捞片机、烤片机(德国Leica公司)，恒温箱(北京永光明医疗器械有限公司)，光学显微镜(日本Olympus)。

1.2 动物分组及ACL重建 将43只(86膝)新西兰大白兔随机分为A组3只、B组8只、C组16只、D组16只。A组不予处理，B组单纯切断双侧ACL(16膝)，C、D组均为切断后急性期右后肢ACL重建(16膝)。C组给予残端鞘内重建，动物称质量后给予舒泰7 mg/kg+速眠新Ⅱ 0.15 mL/kg大腿根部肌注，麻醉成功后，备皮、消毒铺巾。切取同侧跟腱中间1/3为移植腱，长约4 cm，直径2 mm。取髌旁内侧入路，将髌骨向外脱位，在股骨附着处切断ACL，保留滑膜组织。用直径2 mm克氏针自股骨原ACL止点印迹处钻取股骨隧道。分离ACL胫骨残端成圆筒状结构；细导针于残端印迹中心通过，用直径2 mm空心钻沿导针反向扩孔，将移植腱经胫骨隧道从残端中心穿过，使残端像“袖套”包绕移植物。固定移植腱胫骨端和股骨端。生理盐水冲洗切口，逐层缝合。D组给予牵张保残重建术，麻醉、手术入路、移植腱取材、股骨隧道制法同C组。在ACL残端缝1针作为牵引线，胫骨隧道内口定位在ACL足迹中心偏后1 mm处，钻取胫骨隧道，移植腱由胫骨隧道外口向关节内穿入，先固定移植腱胫骨端，伸直位将ACL残端与移植腱缝合，再固定股骨端，残端引线从股骨骨道中穿过，将残端尽量向股骨隧道牵拉，给予残端一定张力。

1.3 标本采集及切片制作 A组作为正常对照选取两侧后肢正常ACL(胫骨端4 mm)。术后3、6周B组分别取4只过量麻醉处死，C、D组各取8只过量麻醉处死。B、C、D组ACL残端用10%多聚甲醛固定，脱水，透明、浸蜡、包埋，制成5 μm厚的移植物切片。

1.4 残端内成纤维细胞计数 采用HE染色法。石蜡切片脱蜡，行梯度乙醇脱水，细胞核染色，分化，脱水，透明，封片。成纤维细胞计数：每张切片取5个高倍视野(10×40)，用鼠标标记成纤维细胞，IPP 图像分析系统下进行细胞计数，取其平均值。

1.5 残端内成纤维细胞中Ki-67蛋白表达检测 采用免疫组化EnVision二步法。石蜡切片常规脱蜡同HE染色，水化，PBS冲洗，抗原修复，滴加一抗，DAB染色，苏木素复染，脱水，透明，封片。普通显微镜下，Ki-67蛋白阳性定位于细胞核，呈黄褐色染色。随机选取5个高倍视野，每个视野连续计数100个细胞中的阳性细胞数，其平均值为Ki-67蛋白阳性率。

1.6 残端内成纤维细胞凋亡检测 采用TUNEL法。按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，Proteinase K工作液处理标本,TdT和DIG-dUTP反应,加封闭液,抗体稀释,DAB显色,苏木素复染。普通显微镜下，细胞核中出现棕褐色为阳性细胞，即凋亡细胞。随机选取5个高倍视野，每个视野连续计数100个细胞中的凋亡细胞数，计算凋亡率。

2 结果

2.1 各组HE染色观察和成纤维细胞计数比较 A组ACL表面被滑膜组织覆盖，成纤维细胞数量不多，细胞核以椭圆形为主，大多分布于胶原纤维中，呈波浪状有规则排列。术后3周，B、C、D组残端细胞数量增加，排列紊乱，无规律，细胞核多为梭形。术后3、6周，B、C、D组ACL胫骨残端内成纤维细胞数量均多于A组(P均<0.05)，B、C、D组比较差异无统计学意义(P>0.05)；术后6周，B、C、D组成纤维细胞数量较术后3周减少，但仍高于A组(P均<0.05)，排列仍然无序。术后3、6周，B、C、D组ACL胫骨残端内成纤维细胞数量比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组术后各时间点残端内成纤维细胞计数>比较(个，

注：与同时点A组比较，aP<0.05。

2.2 各组残端内成纤维细胞增殖、凋亡比较 术后3、6周，B、C、D组Ki-67蛋白阳性表达率、凋亡率高于A组(P均<0.05)；B、C、D组残端成纤维细胞内Ki-67蛋白阳性表达率、凋亡率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

表2 两组术后各时间点残端内成纤维细胞Ki-67蛋白阳性表达率、凋亡率

注：与A组同时间点比较，aP<0.05。

3 讨论

Lee等[3～5]报道了"残端鞘内重建"和"牵张保残重建"两种保残重建ACL韧带的手术方式，并逐渐被临床熟知。残端鞘内重建的特点是残端形成袖套状结构，移植物从中穿过，残端将移植物充分包裹。牵张保残重建的关键是为了恢复残端的张力，使移植物与残端相互包绕，防止残端回缩形成独眼症。然而哪种术式促进移植腱愈合效果更好目前尚不明确。Jung等[6]在2011年对两种保残手术疗效进行了对比，发现两组国际膝部文件委员会主观膝部评估分级、骨性关节炎评分及关节稳定测量仪侧-侧差值比较无明显统计学差异。但该研究只比较了膝关节稳定性及功能，并未比较两组移植腱愈合情况。

本研究通过动物实验，建立残端鞘内重建和牵张保残两种手术模型，并观察两种不同保残重建术后ACL残端内成纤维细胞的增殖及凋亡情况，希望从组织学层面论证两种保残术式之间的差异。Ki-67被认为是增殖细胞的标志性抗原[7]，与细胞有丝分裂密切联系，对蛋白酶十分敏感，半衰期很短，是反映细胞增殖的敏感指标。其准确性明显高于增殖细胞核抗原指数和DNA倍增含量,已被广泛用于多种细胞增殖的检测[8]，可以较好地反映成纤维细胞的增殖情况[9]。细胞凋亡是细胞在不同基因调控下的程序性死亡[10]，TUNEL法将分子生物学与组织学紧密结合，可对已经凋亡的细胞核或凋亡小体进行标记，能准确反映细胞凋亡情况。TUNEL法在细胞DNA断裂的凋亡早期就可显示出细胞内的凋亡小体，比电镜检查能更早发现凋亡细胞。目前随着运动医学的不断发展，证实细胞凋亡与组织退变密切相关[11]。

保残的初衷是希望残端内残存的细胞、血管能够充当细胞源泉的角色并与移植腱充分融合。残端能够按照预期完成韧带化任务的前提必须是自身具备愈合能力。Nguyen等[12]对ACL完全断裂患者的ACL残端进行活检，发现ACL断裂后，残端内血管、细胞增殖明显，其中以成纤维细胞为主，展现出了一定的细胞增殖活性和自愈能力。移植肌腱的重塑需经历缺血坏死、血管和滑膜长入、细胞(成纤维细胞为主)再生、胶原重排和重塑等过程。如果ACL残端内的成纤维细胞能够迁移至移植腱内，或许能够加速移植腱的成熟。因此，本研究探讨两种保残重建术式对ACL残端成纤维细胞数量及生物活性的影响。结果发现，术后3、6周残端B、C、D组ACL残端内细胞数量明显增加，以成纤维细胞为主，与以上研究报道一致。B、C、D组残端内成纤维细胞数量迅速增多，估计是残端断裂后炎症的刺激，加之残端有一定的自愈倾向。但三组成纤维细胞增殖、凋亡在术后3、6周比较差异无统计学意义。究其原因可能为：①牵张保残重建ACL虽然给予残端一定机械张力，但这种张力既未促进成纤维细胞的DNA合成，使增殖增加，也未减少其凋亡。虽然成纤维细胞对外源性张力的刺激极为敏感，适当的机械张力不但能够促进成纤维细胞的增殖和生物学活性，也能减少成纤维细胞的凋亡[13]。牵张保残重建ACL术的目的之一也是给予ACL残端一定的张力，以保持ACL实质内细胞的活性。然而目前牵张应力对成纤维细胞增殖活性影响的研究还处于起步阶段，仍有大量问题未解决，牵引力的大小、作用方式、作用周期都会对成纤维细胞的增殖造成不同的影响。张晓东等[14]研究不同大小应力对成纤维细胞增殖的影响，结果显示，6%、12%牵张力能够促进成纤维细胞的增殖，而18%牵张力却抑制成纤维细胞的增殖。可见在一定范围内的牵张力能促进成纤维细胞增殖，并不是所有牵张力都具有促进细胞增殖作用。另有研究显示，牵张力的频率、次数、周期性都会对细胞增殖产生不同的影响。牵张保残重建ACL虽然将残端牵引入股骨隧道并缝合在移植物上，但所产生的牵张力可能并未达到促进成纤维细胞增殖及减少其凋亡的作用[15]。②术后膝关节未制动，交叉韧带残端同移植物缝合后，韧带残端会随移植物的运动而移动，移植物在术后膝关节屈伸过程中张力不断变化，因而并不能保证残端始终保持合适的张力。综上可以看出，两种手术方式术后残端成纤维细胞增殖无明显差异。本研究发现，无论是“残端鞘内重建”还是“牵张保残重建”，ACL残端内成纤维细胞数量、增殖率和凋亡率都随时间变化而变化。即细胞数量、增殖率在术后早期增加，随时间延长而逐渐降低；而凋亡率则随时间延长而逐渐增加。原因可能为在ACL断裂后，断端的炎症反应有一定的自愈倾向；但随着炎症的吸收及ACL残端的废用，韧带内的实质细胞数量逐渐降低。同时本研究还发现，术后3、6周ACL残端成纤维细胞增殖、凋亡均高于正常ACL，其具体原因仍不得而知，希望通过后续实验进一步探讨。

综上所述，“残端鞘内重建”和“牵张保残重建”两种保残术式残端内成纤维细胞增殖和凋亡差异无统计学意义，牵张保残重建ACL并未体现出更强的保持残端内细胞活性作用。本研究尚存在不足之处：①动物造模是在切开关节囊的情况下进行，手术创伤不可避免地要比关节镜下微创手术大，关节内炎症反应和愈合过程可能也与临床存在一定差异。②实验对象是新西兰大白兔，因为种属差异，其组织学变化可能与人类存在一定差异。