鸡骨草叶中N-反式对香豆酰酪氨酸的纯化工艺优化Δ

门丽娇，刘亚迪，邱雨，袁旭江

（广东药科大学新药研发中心，广州510006）

N-反式对香豆酰酪氨酸[N-（E）-p-coumaroyltyrosine］为酚类氨基酸衍生物，最早被发现于非洲黑木树皮中[1］。随着研究的不断深入，至今发现含有该成分的植物还有可可[2］、山茱萸根[3］、阔叶野韭菜花和茎[4］、常春藤新鲜叶子[5］等。在生物活性方面，Osakabe N[6］通过实验动物模型研究了含有N-反式对香豆酰酪氨酸的可可提取液中粗多酚的生物活性，结果表明其对乙醇诱导的胃溃疡具有一定的保护作用，可抑制维生素E缺乏大鼠的氧化应激，降低高胆固醇血症模型兔的氧化敏感性，抑制小鼠皮肤的癌变，同时还可抑制杂环胺的致突变作用。Mokhtar M等[7］研究发现，辣椒多酚提取物具有抗菌和抗氧化活性，可降低癌细胞的活力，而N-反式对香豆酰酪氨酸是该提取物可能发挥生物活性的成分之一。抑制一氧化氮（NO）合酶介导的NO过表达可能是治疗包括神经炎性疾病在内的炎症性疾病的药物靶点。Hu XL等[8］利用酶活性和对接试验显示，N-反式对香豆酰酪氨酸对诱导型靶标产生的NO合酶有抑制作用。由此可见，N-反式对香豆酰酪氨酸具有多种生物活性，但其在植物纯化富集和分析方面的研究较少。笔者在前期研究中发现，鸡骨草叶中含有N-反式对香豆酰酪氨酸，且含量较高[9-10］。为此，本研究在建立测定鸡骨草叶中N-反式对香豆酰酪氨酸含量高效液相色谱法（HPLC）的基础上，采用单因素试验优化N-反式对香豆酰酪氨酸的纯化工艺，旨在为其开发利用和质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪，包括二极管阵列检测器、真空脱气机、四元泵、自动进样器和柱温箱（美国Agilent公司）；BP211D型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；JJ1000型千分之一电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；BHS-4型数显恒温水浴锅（江阴市保利科研器械有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药品与试剂

N-反式对香豆酰酪氨酸对照品（广东药科大学新药研发中心自制，批号:20180601，纯度:＞99%）；聚酰胺树脂（100～200目，台州市路桥四甲生化塑料厂）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯净水。

1.3 药材

24批鸡骨草叶药材（编号:S1～S24）经广东药科大学新药研发中心袁旭江副研究员鉴定分别为豆科（Leguminosae）植物相思子属（Abrus Adans.）的广州相思子（Abrus cantoniensisHance）或毛相思子（Abrus mollisHance）的干燥叶。药材样品来源见表1。

表1 药材样品来源Tab 1 Source of medicinal sample

2 方法与结果

2.1 N-反式对香豆酰酪氨酸的含量测定

2.1.1色谱条件色谱柱1:Hypersil BDS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～20 min，33%B→51%B）；流速:1.0 mL/min；柱温:25℃；检测波长:300 nm；进样量:10 μL。在该色谱条件下，N-反式对香豆酰酪氨酸色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数大于5 000，阴性对照对测定无干扰，详见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 对照品溶液的制备 取N-反式对香豆酰酪氨酸对照品适量，精密称定，置于50 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，摇匀，制成质量浓度为5.15 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取药材样品2.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，按照1∶30的比例（g/mL）加入20%乙醇，于95℃加热回流3次，每次1 h，滤过，合并3次滤液，减压回收至无醇味，浓缩液加水定容至50 mL。取全部样品上聚酰胺柱（100～200目，5.0 g，湿法上柱，直径2.5 cm，长40 cm），上样流速1.0 mL/min，依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）洗脱至流出液无色后，再用氨水（pH 10）洗脱至无色，收集氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣置于50 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并定容。取适量经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 取50%乙醇适量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得阴性对照溶液。

2.1.5 线性关系及不同色谱柱适用性考察 取“2.1.2”项下对照品溶液0.5、1、2、5、8、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加50%乙醇定容，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得N-反式对香豆酰酪氨酸回归方程为y＝441.34x－8.259 4（r＝0.999 9）（色谱柱1）；y＝447.20x－64.309 0（r＝0.999 9）[色谱柱 2:Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）］，表明N-反式对香豆酰酪氨酸检测进样量的线性范围为2.575～51.50 μg，详见表2。

表2 不同色谱柱的线性关系及适用性考察结果Tab 2 Linear range of different chromatogram column and suitability

2.1.6 定量限与检测限考察 取“2.1.2”项下对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10∶1、3∶1分别计算定量限、检测限。结果，N-反式对香豆酰酪氨酸的定量限为0.000 618 μg、检测限为0.000 129 μg。

2.1.7 精密度试验 取“2.1.3”项下供试品溶液（编号:S15）10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件于同日内连续进样测定6次，记录峰面积。结果，N-反式对香豆酰酪氨酸峰面积的RSD为1.15%（n＝6），表明本方法日内精密度良好。精密量取“2.1.3”项下供试品溶液（编号:S15）10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定3 d，记录峰面积。结果，N-反式对香豆酰酪氨酸峰面积的RSD为1.14%（n＝3），表明本方法日间精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液（编号:S15）适量，分别于室温放置0、2、4、6、8、12、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，N-反式对香豆酰酪氨酸峰面积的RSD为0.30%（n＝7），表明供试品溶液于室温下放置24 h内基本稳定。

2.1.9 重复性试验 取药材样品（编号:S15）适量，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按回归方程计算样品含量。结果，N-反式对香豆酰酪氨酸的平均含量为11.81 mg/g，RSD为2.43%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验 取已知含量的药材样品（编号:S15）1.0 g，精密称定，共6份，分别加入一定量的N-反式对香豆酰酪氨酸对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.1.11 样品含量测定 取24批样品，每批2.0 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，平行操作3次，记录峰面积并按回归方程计算样品含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3）

2.1.12 干膏含量及干膏纯度测定 供试品溶液用氨水洗脱后，定容至50 mL，取40 mL，按2015年版《中国药典》（三部）通则干燥失重法干燥后得样品干膏[11］，并计算干膏含量及干膏纯度。干膏含量（mg/g）＝（减失的质量×5/4）/样品质量；干膏纯度（%）＝N-反式对香豆酰酪氨酸在样品中的含量/干膏含量×100%，结果见表4；干膏含量与干膏纯度的相关性散点图见图2。由图2可知，干膏含量与干膏纯度存在线性关系（R2＝0.834 1）。

图2 相关性散点图Fig 2 Scattered plot of correlation

2.2 N-反式对香豆酰酪氨酸纯化工艺优化

2.2.1 纯化前样品溶液制备 取药材样品40.0 g，置于圆底烧瓶中，按照1∶30的比例（g/mL）加入20%乙醇，于95℃加热回流3次，每次1 h，滤过，合并3次滤液，减压回收至无醇味，浓缩液加水定容至1 000 mL，即得。

2.2.2 洗脱溶剂考察 称取聚酰胺树脂5.0 g，共2份，每份分为2柱，分别湿法上柱，取“2.2.1”项下样品溶液50 mL，上样流速1.0 mL/min，静置吸附时间20 min，样品溶液质量浓度0.04 g/mL（以鸡骨草叶药材计，下同），每柱依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）洗脱至流出液无色，分别收集水洗脱液、乙醇洗脱液和氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加50%乙醇定容至25 mL，每个样品平行2份，取适量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，水洗脱液、乙醇洗脱液中N-反式对香豆酰酪氨酸得率均为0，但水溶性杂质和黄酮类成分被洗脱，氨水洗脱液中N-反式对香豆酰酪氨酸得率分别为96.27%、100.03%，提示N-反式对香豆酰酪氨酸被富集在氨水洗脱液中，故选择用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）为洗脱溶剂依次洗脱，并收集氨水洗脱液进行含量测定（氨水洗脱液中N-反式对香豆酰酪氨酸的质量/样品溶液中N-反式对香豆酰酪氨酸的质量×100%）。

2.2.3 静置吸附时间考察 称取聚酰胺树脂5.0 g，共6份，分为3组（每组2柱），分别湿法上柱，取“2.2.1”项下样品溶液50 mL，上样流速1.0 mL/min，样品溶液质量浓度0.04 g/mL，每组分别静置吸附5、10、20 min，每柱依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）洗脱至流出液无色，弃去水洗脱液、乙醇洗脱液，分别收集每柱的氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加50%乙醇定容至25 mL，每个样品平行2份，取适量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，N-反式对香豆酰酪氨酸得率分别为94.34%、98.65%、99.65%。这提示静置吸附时间越长，N-反式对香豆酰酪氨酸吸附得越紧密，在前期经水、乙醇洗脱时越不易随杂质洗脱，综合考虑，最终选择静置吸附时间为20 min。

2.2.4 上样量考察 称取聚酰胺树脂5.0 g，共6份，分为3组（每组2柱），分别湿法上柱，取“2.2.1”项下样品溶液30、50、70 mL，上样流速1.0 mL/min，静置吸附时间20 min，样品溶液质量浓度0.04 g/mL，每柱依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）洗脱至流出液无色，弃去水洗脱液、乙醇洗脱液，分别收集每柱的氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加50%乙醇定容至25 mL，每个样品平行2份，取适量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，N-反式对香豆酰酪氨酸得率分别为100.11%、100.02%、97.05%。这提示当上样量为70 mL时，N-反式对香豆酰酪氨酸不能被聚酰胺树脂完全吸附，综合考虑，最终选择上样量为50 mL。

2.2.5 样品溶液质量浓度考察 称取聚酰胺树脂5.0 g，共6份，分为3组（每组2柱），分别湿法上柱，取“2.2.1”项下样品溶液50 mL，分别制成质量浓度为0.02、0.04、0.06 g/mL的上样液，上样流速1.0 mL/min，静置吸附时间20 min，每柱依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）洗脱至流出液无色，弃去水洗脱液、乙醇洗脱液，分别收集每柱的氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加50%乙醇定容至25 mL，每个样品平行2份，取适量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，N-反式对香豆酰酪氨酸得率分别为101.32%、100.22%、100.42%。这提示当样品溶液质量浓度为0.02～0.06 g/mL时，N-反式对香豆酰酪氨酸均可被全部洗脱下来，考虑到实际操作，最终选择样品溶液质量浓度为0.04 g/mL。

2.2.6 酸性洗脱溶剂含酸量考察 称取聚酰胺树脂5.0 g，共6份，分为3组（每组2柱），分别湿法上柱，取“2.2.1”项下样品溶液50 mL，上样流速1.0 mL/min，静置吸附时间20 min，样品溶液质量浓度0.04 g/mL，每柱依次用不含乙酸、含0.1%乙酸、含0.2%乙酸的水和不含乙酸、含0.1%乙酸、含0.2%乙酸的20%乙醇、氨水（pH 10）洗脱至流出液无色，弃去水洗脱液、乙醇洗脱液，分别收集每柱的氨水洗脱液，减压浓缩至干，残渣加50%乙醇定容至25 mL，每个样品平行2份，取适量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，N-反式对香豆酰酪氨酸得率分别为0、100.20%、101.12%。这提示在洗脱溶剂中增加适量的乙酸可使N-反式对香豆酰酪氨酸在聚酰胺树脂上的吸附力加大，提高得率，考虑到经济成本，最终选择酸性洗脱溶剂为水（含0.1%乙酸）。

2.2.7 验证试验 按上述考察结果得到最优纯化工艺为0.04 g/mL样品溶液50 mL、上样流速1.0 mL/min、静置吸附时间20 min，以水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）为洗脱溶剂依次洗脱，在此纯化工艺条件下制备N-反式对香豆酰酪氨酸，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，平行操作3次，结果见表5。

表5 验证试验结果（n＝3）Tab 5 Results of verification test（n＝3）

3 讨论

鸡骨草叶总提取液工艺可将N-反式对香豆酰酪氨酸完全提取。笔者在富集纯化时通过比较发现，使用聚酰胺树脂比硅胶、大孔树脂吸附效果更好，且提取液中加入少量乙酸可较好地促进目标成分的吸附，去除黄酮类等杂质。故选择洗脱溶剂、静置吸附时间、上样量、样品溶液质量浓度和酸性洗脱剂含酸量为考察因素，进一步探讨这些因素对N-反式对香豆酰酪氨酸纯化富集的影响，以筛选出最佳工艺参数，为后期高纯度单体制备提供依据。

本研究采用HPLC法进行含量测定时，得到了较为单一的N-反式对香豆酰酪氨酸峰，这为N-反式对香豆酰酪氨酸的分析和质量评价提供了有利的分析条件。通过不同色谱柱适用性和方法学考察，发现该方法专属性较强，且色谱柱的长短对该成分的分析无显著影响。为实现快速分析，本试验最终采用短柱进行含量测定。

笔者通过对不同来源鸡骨草叶进行含量测定时发现，广州相思子和毛相思子的样品含量范围分别为3.18～25.70、7.95～31.85 mg/g；相对于广东，广西产鸡骨草叶中N-反式对香豆酰酪氨酸含量相对较低，提示产地不同可导致成分含量存在一定的差异；另外，采收期的不同也可使样品含量存在一定的差异[12］，但是否具有规律性有待后续研究进一步探讨。不同来源鸡骨草叶中N-反式对香豆酰酪氨酸干膏纯度为4.95%～61.99%，经相关性分析结果显示，干膏纯度与干膏含量存在线性关系，这为后期N-反式对香豆酰酪氨酸的进一步纯化及单体制备的选材奠定了基础。

综上所述，所建含量测定方法简便、准确、稳定性较好；优化所得工艺稳定、可行。