高精度定量毛细管电泳法同时测定复合维生素B片中B1、B2、B6、烟酰胺及泛酸钙

2019-05-30胡雯雯陶建伟王庆伟

色谱 2019年6期

胡雯雯, 陶建伟, 王庆伟, 李静, 阎超, 许旭*

(1. 上海应用技术大学化学与环境工程学院, 上海 201418; 2. 上海通微分析技术有限公司, 上海 201203; 3. 上海交通大学药学院, 上海 200240)

复合维生素B片主要用于预防和治疗B族维生素缺乏所致的营养不良、厌食、脚气病、糖尿病等。按照卫生部标准WS1-73(B)-89[1],每片复合维生素B片含5种B族维生素的量为:维生素B13 mg,维生素B21.5 mg,烟酰胺10 mg,维生素B60.2 mg,右旋泛酸钙1 mg。按照标准分别采用重量法测定维生素B1的含量,紫外分光光度法测定维生素B2的含量,滴定法测定烟酰胺的含量。该操作繁琐,且没有维生素B6和泛酸钙的含量测定方法。

文献报道中复合维生素B片的含量测定多采用HPLC法、毛细管电泳法、LC-MS联用法以及定量核磁共振波谱法。采用HPLC法[2-8]测定复合维生素B片中维生素成分的含量时,其中泛酸钙的含量测定方法较少提及,仅徐硕等[9]报道了HPLC同时测定一种进口复合维生素B片中这5种维生素含量的方法。本实验室[10]建立了用定量核磁共振波谱测定复合维生素B片中除维生素B6的4种成分含量的方法。Eiff等[11]用定量核磁共振法分析水溶性和脂溶性维生素,但未对维生素B2进行定量分析。也有采用LC-MS法对B族水溶性维生素进行分析的报道[12,13]。毛细管电泳法测定的复合维生素B片中的成分主要是维生素B1、烟酰胺、维生素B2和维生素B6,也均未涉及泛酸钙含量的测定,且通常测定精密度不高。Huopalahti等[14]采用区带电泳法测定各组分峰面积的RSDs为2.1%～6.3%。Boonkerd等[15]针对精密度问题还使用了内标物质进行校正计算。另外一些使用普通毛细管电泳仪测定复合维生素B片的文献报道中精密度(RSD)分别为3.5%～4.8%[16]和1.8%～4.7%[17]。

高精度定量毛细管电泳仪通过引入具有精确内部定量环的nL级进样阀,改善了进样体积精度,配合相应的自动进样控制系统和毛细管温控系统,有助于提高毛细管电泳的定量重复性和准确度[18,19]。本研究使用高精度定量毛细管电泳仪,建立了高精度同时测定复合维生素B片中5种维生素含量的方法,获得了较好的定量精密度。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

高精度定量毛细管电泳仪包括自动进样器、紫外检测器、高压电源、微流注射泵、四通进样阀及qSepTM-3010色谱工作站(上海通微分析技术有限公司)。精密天平(M2P型,精度为0.001 mg,德国Sartorius公司)。带有电隔离槽的石英毛细管(进样端带隔离槽,内径75 μm,总长度65 cm,有效长度45 cm,上海通微分析技术有限公司)。

维生素B1(盐酸硫胺素,含量98%)、维生素B2(核黄素,含量98%)、烟酰胺(含量99%)均购自上海阿达玛斯试剂有限公司;泛酸钙对照品(含量97.5%)购自中国药品生物制品检定院;维生素B6(盐酸吡多辛,HPLC级,含量98%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;十水合四硼酸钠和硼酸均为分析纯,购自上海国药试剂有限公司;乙腈(HPLC级)购自上海泰坦科技有限公司;蒸馏水购自屈臣氏;复合维生素B片药品均购自上海零售药房。

1.2 样品预处理

取10片复合维生素B片,计算平均片重,置研钵中研成细粉,从中取0.43 g样品置于10 mL离心管中,加9 mL乙腈-水(20∶80, v/v),涡旋振荡2 min,在60 ℃超声提取至溶液中粉末为白色,在3 000 r/min条件下离心3 min后取上清液,过0.22 μm水相滤膜,得到复合维生素B片提取溶液。

5种维生素均用乙腈-水(20∶80, v/v)配制混合储备溶液,其维生素B1、B2、B6、烟酰胺和泛酸钙的质量浓度分别为5.04、1.07、2.71、16.46和5.19 g/L。混合储备溶液分别用乙腈-水(20∶80, v/v)稀释1、2、5、10、25和50倍,配制成混合维生素样品溶液。

1.3 毛细管电泳实验

新毛细管按其使用说明用超纯水冲洗30 min,每次实验前用pH 9.0硼砂-硼酸缓冲液冲洗毛细管柱30 min,两次进样间隔使用冲洗程序清洗进样针头和进样管路,实验当天完成样品分析后用流速为0.8 μL/min的乙腈-水(10∶90, v/v)冲洗毛细管柱至少1 h。

分离缓冲液为40 mmol/L pH 9.0硼砂-硼酸缓冲液。分离过程中注射泵以1.0 μL/min的流速持续通入分离缓冲液,该分离缓冲液分流后通过分离毛细管。进样电压为-10 kV。进样量为10 nL(定量阀自动进样)。没有使用毛细管柱温控制系统。检测波长在10 min内为280 nm,用于检测维生素B1、B2、B6和烟酰胺,10 min以后转换为210 nm,用于检测泛酸钙。

2 结果与讨论

2.1 毛细管电泳分离结果

使用选定的毛细管电泳条件,混合维生素样品溶液和复合维生素B片提取溶液中各成分可在15 min内完全分离,结果见图1。

图 1 (a)5种维生素混合溶液和(b)复合维生素B片提取溶液的电泳图Fig. 1 Electrophoregrams of (a) the mixture of five vitamins and (b) multivitamin B tablet extract solution Peak Nos: 1. vitamin B1(thiamin); 2. nicotinamide; 3. vitamin B2(riboflavin); 4. vitamin B6(pyridoxine); 5. pantothenate.

2.2 样品提取溶剂的选择

维生素B1、B6、烟酰胺和泛酸钙的水溶性较好。维生素B2微溶于水,尽管在碱性溶液中容易溶解,但维生素B1和B6在碱液中易被破坏。可通过添加乙腈[15]提高维生素B2的溶解性,并可保证其他4种维生素均可溶解。试验比较了不同比例乙腈的提取效果,使用10%(体积分数,下同)乙腈提取时,维生素B2的测定结果偏低;而使用高于20%的乙腈提取时,含量测定结果基本不变。考虑到纯乙腈可能影响后面的毛细管电泳分离,故提取溶剂选择为乙腈-水(20∶80, v/v)。样品预处理方法见1.2节。

2.3 缓冲液浓度的影响

缓冲液浓度是影响分析物迁移行为的重要因素。随着硼砂缓冲液浓度的增加,5种分析物的迁移时间不断增大(见图2a),其分离度(见图2b)和峰形也越来越好,并在40 mmol/L时获得了最好的分离效果。继续增大缓冲液浓度至50 mmol/L,电流较大,较高的电流会产生大量的焦耳热,导致基线不平、分离效率下降。故最终确定硼砂缓冲液的浓度为40 mmol/L。

图 2 缓冲液浓度对(a)迁移时间和(b)分离度的影响Fig. 2 Effects of buffer concentrations on (a) migrationtime and (b) resolutionThe subscripted number after R is the peak number of the two adjacent peaks in Fig. 1.

2.4 缓冲液pH的影响

缓冲液pH是影响分离及电渗的关键因素。考察了缓冲液不同pH值对分离的影响,结果见图3。在pH 9.0时5种成分可在较短的迁移时间实现完全分离。当pH继续增大,电流上升,焦耳热增大引起区带展宽,导致最后两个峰(维生素B2和泛酸钙)的分离度变差。

2.5 分离电压的影响

电压越高,分离时间越短,但在高压下焦耳热会增大引起峰展宽。比较了电压为-5、-8、-10、-15 kV(相应的电流在13到48 μA)的效果,结果在较低电压(-5和-8 kV)时,分离时间较长,维生素B2和B6不能完全分开。在-10 kV电压下,5种成分完全分离。

2.6 检测波长的选择

文献[2,5,9,20]报道维生素B1、B2、B6和烟酰胺可在266、270、275、280 nm处进行紫外检测,试验比较了266～280 nm处的检测效果。结果显示,波长增大,烟酰胺峰高减小,维生素B6峰高增大。实际样品中因烟酰胺含量高,而维生素B6含量低,故选择280 nm作为检测波长。泛酸钙仅在低波长处有末端吸收,故选择210 nm作为其检测波长。由于9.5 min时,前面4种物质已完成分离,而泛酸钙在10.5 min以后才开始出峰,因此使用波长转换的程序设置,前10 min的检测波长设置为280 nm,在10 min时转换波长为210 nm以检测泛酸钙。

2.7 添加剂的影响

为了控制电渗、改善分离选择性以及减少毛细管内壁吸附,考察了在缓冲液中加入羟丙基-β-环糊精、乙腈、甜菜碱和EDTA的分离效果。结果显示,缓冲液中加入这些添加剂对组分的迁移和分离并无明显改善。故没有使用添加剂。

2.8 毛细管柱温的影响

比较了室温(不控温)和恒温(20 ℃,使用毛细管柱温控制系统)对峰面积重复性的影响,结果恒温对精密度有改进,但两者精密度RSD的最大值相差不大,为操作方便,使用不控温的室温实验。

2.9 方法学验证

2.9.1线性关系和检出限

精密取一定量的对照品混合液配制6个不同浓度标准溶液,以峰面积为纵坐标、质量浓度(g/L)为横坐标绘制标准曲线。结果(见表1)表明,5种化合物在实验浓度范围内呈现线性关系,相关系数(r)为0.996 8～0.999 8。对标准溶液逐渐稀释,取信噪比(S/N)为3时组分的质量浓度为检出限(LOD)。

y: peak area;x: mass concentration, g/L.

2.9.2精密度

配制维生素B1、烟酰胺、维生素B2、维生素B6和泛酸钙的标准混合溶液,在一天8 h内重复测定6次,维生素B1、烟酰胺、维生素B2、维生素B6和泛酸钙的峰面积日内RSD值分别为1.9%、1.4%、1.3%、1.7%和1.7%。文献中采用电泳法测定不同维生素的RSDs分别为2.1%～6.3%[14]、7%～10%(非内标校正方法)[15]、3.5%～4.8%[16]和1.8%～4.7%[17],显示本方法及仪器精密度优于文献方法。

配制维生素B1、烟酰胺、维生素B2、维生素B6和泛酸钙的标准混合溶液,连续测定6天,计算日间精密度的峰面积RSDs值(n=6)在3.1%～5.7%之间,低于上述日内精密度,而且重复测定日内和日间精密度仍然如此。推测原因可能是过夜后有样品成分不稳定[21]。因此已配制溶液要在一天内完成测定。

2.9.3回收率

分两批在已知含量的复合维生素B片中分别加入前3种组分(维生素B1、烟酰胺和维生素B2)和后2种组分(维生素B6和泛酸钙)的对照品,分别进行6次平行试验。测定并计算各组分的平均回收率和RSDs,结果见表2。复合维生素B片的加标回收率为94.07%±5.30%～98.87%±3.99%,相对标准偏差为2.9%～5.6%。