加速溶剂萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中拟除虫菊酯类农药残留

焦慧泽, 陆世清, 侯 迪, 张前前*

(1. 钦州海关国家燕窝及营养保健品监测重点实验室(钦州), 广西 钦州 535000; 2. 中国海洋大学化学化工学院, 山东 青岛 266100)

拟除虫菊酯类农药是一类人工合成的模拟天然除虫菊素的新型杀虫剂, 占全球杀虫剂市场的20%左右[1],具有杀虫谱广、快速、高效等优点,被广泛应用于害虫防治工作[2]。茶是我国的传统饮品,但目前茶叶的生产中存在农药滥用现象,其中拟除虫菊酯类农药滥用尤为严重[3]。拟除虫菊酯类农药的某些种类(如溴氰菊酯等)有致癌、致畸和致突变作用[4,5],因此建立茶叶中拟除虫菊酯类农药测定新方法具有重要意义。

目前,针对拟除虫菊酯类农药的测定方法主要有气相色谱-电子俘获检测器(GC-ECD)[6-8]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[9,10]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[11-13]、薄层色谱法[14]、高效液相色谱法(HPLC)[15,16]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[17,18]等。相比较其他方法,LC-MS/MS具有不需要耗时长的程序升温过程、不需要复杂的衍生化处理、假阳性率低、灵敏度高、准确度高等优势,符合当前检测要求的快速、准确、高效原则。目前尚未见LC-MS/MS测定茶叶中氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等多种拟除虫菊酯类农药的报道。

加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction, ASE)在萃取过程中对萃取溶剂加压,使其在高于沸点温度时仍可保持液态,而液体的溶解能力远大于气体的溶解能力,同时提高的温度也能有效降低目标物分子与基质间的作用力[19],因此该方法有有机溶剂用量少、快速、基质影响小、萃取效率高和重现性好等优点。本文将ASE与LC-MS/MS有机结合,优化了萃取、净化过程及色谱-质谱条件参数,可快速、准确、高效地测定茶叶中拟除虫菊酯类农药残留。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LCMS-8040超高效液相色谱-质谱联用仪,配电喷雾离子源(ESI)(日本Shimadzu公司), APLE-2000加速溶剂萃取仪(北京吉天仪器有限公司), KQ-700DE超声波清洗器(昆山舒美公司), JHD-12A全自动氮吹仪(上海极恒公司), HSC-12B水浴氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司), T18 digital Ultra-Turrax均质器和MS3 digital涡旋振荡器(德国IKA公司),高速离心机(H1850,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司), Arium comfort Ⅰ超纯水装置(德国Sartorius)。

生物苄呋菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟氰戊菊酯标准品(100 mg/L)均购于北京坛墨质检科技有限公司,GCB/NH2固相萃取柱(500 mg/500 mg, 6 mL,上海安谱实验科技股份有限公司), Florisil固相萃取柱(1 g, 6 mL,上海安谱实验科技股份有限公司),乙腈、甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、环己烷、二氯甲烷(色谱纯,德国Merck公司),甲酸(色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司),氯化钠、无水硫酸钠(分析纯,广东光华科技股份有限公司)在500 ℃马弗炉中灼烧4 h后置于干燥器中冷却至室温备用,乙酸铵(分析纯,广东光华科技股份有限公司)。

1.2 样品前处理

1.2.1ASE萃取

准确称取5 g已粉碎的茶叶样品(精确至0.01 g),上加速溶剂萃取仪,移入已加入2 g硅藻土的34 mL萃取池中,再覆盖1 g硅藻土。萃取温度80 ℃,萃取压力10.34 MPa(1 500 psi),加热5 min,以正己烷-丙酮(2∶1, v/v)为溶剂静态萃取5 min,冲洗体积为60%萃取池体积,60 s氮气吹扫,循环一次,萃取完成。收集提取液,于全自动氮吹仪中在40 ℃氮吹浓缩至小于3 mL,加入少量正己烷溶解壁上残渣,待净化。

1.2.2固相萃取净化

取GCB/NH2+Florisil串联柱,在GCB/NH2柱上方装约1 cm高的无水硫酸钠,并依次用5 mL正己烷-丙酮(9∶1, v/v)活化、5 mL正己烷平衡。将待净化液移入活化后的小柱,用10 mL正己烷-丙酮(9∶1, v/v)溶液分两次洗脱,收集洗脱液,置于40 ℃水浴中氮吹近干,用1 mL初始流动相溶解残渣,过0.22 μm滤膜后待上机。

1.3 色谱、质谱条件

1.3.1液相色谱条件

色谱柱:Shim-pack GIST C18柱(50 mm×2.1 mm, 2 μm);流动相:A为5 mmol/L乙酸铵+0.1%(v/v)甲酸水;B为甲醇;梯度洗脱条件:0～2 min, 20%A; 2～3.5 min, 20%A～10%A; 3.5～7 min, 10%A; 7～8 min, 10%A～20%A; 8～10 min, 20%A。柱温:40 ℃;流速:0.4 mL/min;进样量:1 μL。

1.3.2质谱条件

离子源:ESI;扫描方式:正离子扫描;雾化气流速:3 L/min;干燥气流速:15 L/min; 去溶剂管温度:250 ℃;加热块温度:400 ℃;检测器电压:1.74 kV;喷嘴电压:4.5 kV;碰撞室气体压力:230 kPa;检测模式:MRM。其他质谱参数(母离子、子离子、Q1预偏置电压、碰撞能量、Q3预偏置电压)见表1。

表 1 10种拟除虫菊酯类农药的离子对及相关电压参数

CE: collision energy; * quantitative ion.

2 结果和讨论

2.1 色谱、质谱条件的优化

考察了以甲醇-水和乙腈-水为流动相时,ESI源正、负模式下10种拟除虫菊酯类农药的响应,实验表明,ESI+下10种农药的响应明显优于ESI-,因此选用ESI+对目标物进行测定。

流动相组成对LC-MS/MS的检测影响较大,在对流动相为甲醇-水和乙腈-水的一级质谱的解析中发现,除生物苄呋菊酯、氟胺氰菊酯和甲氰菊酯有丰度较高的[M+H]+外,其余7种农药的加和离子主要为[M+NH4]+和[M+Na]+,且[M+Na]+丰度最高,但以[M+Na]+为母离子时,无法得到稳定且丰度较高的子离子,因此考虑在水相中添加乙酸铵和甲酸以增强[M+H]+和[M+NH4]+的丰度以用于定量分析。向水相中添加一定乙酸铵至5 mmol/L和甲酸(0.1%, v/v),发现在加入乙酸铵或甲酸后,相对应的[M+H]+以及[M+NH4]+的丰度均较未加入时有显著提高,比较了有机相分别为甲醇和乙腈时的加和物离子信号响应,结果表明应用甲醇时的离子化效率优于乙腈。比较了有机相为甲醇,水相分别为5 mmol/L乙酸铵、0.1%(v/v)甲酸、5 mmol/L乙酸铵-0.1%(v/v)甲酸、10 mmol/L乙酸铵-0.1%(v/v)甲酸时,各化合物加和离子的丰度以及信号响应,试验得出水相为5 mmol/L乙酸铵-0.1%(v/v)甲酸时其离子化效率最高;同时优化了该流动相条件下的梯度洗脱程序,优化后的色谱条件见1.3.1节。

在优化好的色谱条件下对质谱检测的子离子、四极杆预偏置电压、碰撞能量等进行优化。选择信号强度高、响应稳定、质荷比较大的2个碎片离子作为子离子。在MRM模式下针对四极杆预偏置电压和碰撞能量进行了优化,试验表明,Q1预偏置电压、Q3预偏置电压、CE分别在10～22 V、13～29 V、11～39 V范围内,质谱对应的响应值最优。最终优化结果见表1,优化条件下的色谱图见图1。

图 1 加标绿茶中10种拟除虫菊酯类农药的提取离子流色谱图(0.1 mg/kg)Fig. 1 Extracted ion current (EIC) chromatograms of the 10 pyrethroid pesticides spiked in green tea (0.1 mg/kg) 1. flucythrinate; 2. fenpropathrin; 3. cyfluthrin; 4. cyhalothrin; 5. deltamethrin; 6. fenvalerate; 7. tau-fluvalinate; 8. bioresmethrin; 9. permethrin; 10. bifenthrin. Bule peak: quantitative ion; red peak: qualitative ion.

2.2 提取方式的选择

目前针对茶叶中农药残留提取的传统方法主要有振荡、超声及匀浆等,与这些方法相比,ASE具有有机溶剂用量少、操作简单、耗时短、效率高等特点。因未寻得含有全部10种农药的阳性样品,所以选取了一个含有联苯菊酯的红茶样品及一个含有溴氰菊酯的绿茶样品,比较了4种提取方式的检测结果。振荡提取条件[20]:称取1 g已粉碎茶样,加入5.0 mL乙腈后旋涡振荡混合2 min,静置10 min后再旋涡振荡混合2 min,离心3 min(5 000 r/min),将残渣重复提取一次。超声提取条件[21]:称取5 g已粉碎茶样,加入20 mL乙酸乙酯-环己烷(1∶1, v/v)溶液,旋涡1 min,超声20 min后离心10 min(5 000 r/min),将残渣重复提取两次。匀浆提取条件[22]:称取2 g已粉碎茶样,加入2 g氯化钠和10 mL乙腈溶液,在高速组织捣碎机上以15 000 r/min均质提取1 min后离心5 min(4 000 r/min),将残渣重复提取2次(ASE提取条件见1.2.1节)。4种提取结果见图2, 4种提取方法中匀浆及ASE的提取效率较高,而ASE相比较匀浆操作更简便、耗时更短且可以多通道多样品同时处理,更符合实际检测需要,因此本试验选用ASE提取。

图 2 不同提取方式下阳性样品中联苯菊酯、溴氰菊酯的含量Fig. 2 Measured bifenthrin and deltamethrin contents in positive samples using different extraction methods

2.3 ASE萃取条件的优化

2.3.1萃取溶剂的优化

研究了不同体积比(4∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶2, v/v)的正己烷-丙酮作萃取溶剂时10种农药的回收率,发现萃取溶剂中丙酮含量增加时,回收率也相应有所增高,但当丙酮含量高于50%之后,萃取液中杂质含量较高,在浓缩后会有较多黏稠杂质堵塞SPE柱,导致洗脱溶剂难以通过小柱。而从表2中也可以看出,当体积比为2∶1时,回收率在81.7%～93.6%之间,与1∶1、1∶2时相差不大,同时萃取液中杂质含量较少,因此选择正己烷-丙酮(2∶1, v/v)为萃取溶剂。

表 2 采用不同体积比正己烷-丙酮混合溶剂萃取时农药的回收率(n=3)

2.3.2萃取时间及萃取温度的优化

以正己烷-丙酮(2∶1, v/v)为萃取溶剂,比较了不同萃取时间(5、10、15 min)和萃取温度(60、80、100、120 ℃)下农药的回收率。试验中发现,萃取时间对回收率无明显影响,为保证检测效率,选择萃取时间为5 min;而萃取温度大于80 ℃时,回收率再无明显变化,因此在能满足萃取效果的前提下,设定ASE萃取温度为80 ℃。

2.4 固相萃取净化

茶叶中含有大量的色素、多糖等干扰成分,GCB/NH2柱可有效吸附去除色素、有机酸及糖分,而Florisil柱可以强吸附含电负性杂原子的极性干扰物,因此本实验采用GCB/NH2+Florisil串联柱净化。

GCB/NH2柱和Florisil柱均为正相填料的固相萃取小柱,因此正己烷等非极性溶剂洗脱效果较差,而加入二氯甲烷、丙酮等溶剂会增强其洗脱效果。取4份空白样品待净化样液,各加入10种拟除虫菊酯类标准物质75 ng,以10 mL溶剂分两次洗脱,考察洗脱液分别为正己烷-二氯甲烷(9∶1, v/v)、正己烷-丙酮(9∶1, v/v)、正己烷-二氯甲烷(8∶2, v/v)、正己烷-丙酮(8∶2, v/v)时定容至1 mL的回收率,发现洗脱液为正己烷-丙酮(9∶1, v/v)、正己烷-丙酮(8∶2, v/v)时的回收率较好,而正己烷-丙酮(9∶1, v/v)洗脱液中残留杂质量较少,因此选择正己烷-丙酮(9∶1, v/v)溶液洗脱。

2.5 检出限、定量限及线性范围

以初始流动相配制了质量浓度分别为0.5、1、5、10、20、50、100、200、400和1 000 μg/L的系列标准溶液,按照1.3节中的色谱、质谱条件进行分析,以峰面积(Y)对质量浓度(X,μg/L)进行最小二乘法线性回归分析,其中氯氟氰菊酯及氯菊酯因有同分异构体出现两个峰,采用峰面积加和值为Y值,判断各组分的线性范围。回归方程的方差分析结果表明,F>F0.05(1, 8),p在2.6×10-16～2.1×10-9之间,即各组分峰面积与质量浓度的线性相关关系显著。具体各组分的线性范围、回归方程及相关系数列于表3,相关系数均在0.999 5以上。

本方法的检出限(LOD)、定量限(LOQ)分别根据3倍、10倍信噪比(S/N)计算得出,并换算成样品中的目标物含量见表3。10种拟除虫菊酯类农药的检出限和定量限分别在0.5～5.0 μg/kg和1.6～16.6 μg/kg之间,远低于欧盟、日本及我国规定的最大残留限量要求,符合实际检测需要。

表 3 10种拟除虫菊酯类农药的保留时间、线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.6 方法的回收率和精密度

选取了空白绿茶、红茶、乌龙茶、普洱茶样品作为基质,分别在定量限、0.4 mg/kg以及最高残留限量(maximum residue limit, MRL)[23](无MRL的加入1 mg/kg)共3个水平进行添加回收试验,每种样品在每个水平重复测定7次,具体结果见表4。试验测得回收率为68.7%～103.8%, RSD为0.8%～13.2%,符合农药残留检测的要求。

表 4 10种拟除虫菊酯类农药在4种基质中3个加标水平下的回收率及相对标准偏差(n=7)

表 4 (续)

图 3 空白红茶样品和阳性红茶样品的多反应监测色谱图Fig. 3 MRM chromatograms of a blank black tea sample and a positive black tea sample

2.7 实际样品测试

利用本文方法测定了从市场采集的共27份实际样品。图3为空白样品和阳性样品的MRM色谱图,这一阳性样品中联苯菊酯的含量为2.76 μg/kg。在检测中发现,8份绿茶检出联苯菊酯、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯和溴氰菊酯,5份红茶检出氯氟氰菊酯和联苯菊酯,检出率高达48%,说明茶叶中拟除虫菊酯类农药残留问题需重视。

3 结论

本研究建立了ASE-UPLC-MS/MS测定茶叶中10种拟除虫菊酯类农药残留的方法。与传统方法相比,本方法减少了有机溶剂用量、缩短了检测周期、提高了检测准确性,方法的回收率、精密度满足农药残留检测需要,检出限、定量限能满足欧盟、美国、日本及我国的限量要求。本研究为茶叶中拟除虫菊酯类农药残留的进出口检验、国内市场监管提供了更为环保、快速、准确的检测手段。