贵州非阻塞性无精症与易感基因多态性的相关研究*

王婵娟，何 燕，张 婷，单可人，禹文峰，官志忠，安 宇

(1.贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室,贵阳 550004;2.贵州省医学分子生物学重点实验室,贵阳 550004;3.贵州省人民医院中心实验室,贵阳 550002)

临床调查显示世界范围内约有5%的夫妇受到不孕的困扰，其中有50%是由于男性不育而造成[1]，其中非阻塞性无精症(non-obstructive azoospermia，NOA)是最常见的男性不育症类型之一，其发病率在成年男性中高达1%，该病的发病机制并不十分清楚，目前尚无十分有效的防治手段，给家庭社会带来的危害巨大[2]。越来越多的研究显示遗传因素如影响精子发育的基因与NOA相关[3-11]。近年来，对NOA全基因组关联分析的研究发现了一些潜在的易感基因位点，分别是位于1p13.30、1p36.32、12p12.10及20p13.00的4个单核苷酸多态性(SNP)位点，它们分别对应了PRMT6、PEX10/MMEL1、SOX5和LOC100289473/SIRPA/SIRPG几个相关基因[12]。目前这些位点与无精症之间的相关性并不十分明确，本研究对贵州人群NOA患者及正常健康对照人群中上述易感基因的4个单核苷酸多态性(SNP)位点进行了多态性分析，得到其基因型频率的分布状况，并探讨易感基因的SNP与NOA的关联，以期为早期诊断和干预提供一定的依据和线索。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究在知情同意的原则下随机抽取贵州省人民医院临床确诊的NOA患者病例(疾病组)以及正常健康体检人群(对照组)为研究对象，研究对象均为汉族人群，样本总量319 例，其中对照组174例，年龄(48.3±12.9)岁，疾病组145例，年龄(46.5±20.2)岁。入选的疾病组人群平均不育年限(4.5±1.2)年，临床检查已排除精索静脉曲张、生殖道梗阻、隐睾、附睾损伤等其他泌尿生殖系统疾患，且无特殊病史及家族史，经精液检查，均确诊为NOA。研究对象组间年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2仪器与试剂 (1)试剂：人基因组rs12097821(G/T)、rs2477686(G/C)、rs10842262(G/C)及rs6080550(C/T)SNP位点TaqMan探针分型试剂盒[TaqMan®SNP Genotyping Assays，英潍捷基(上海)贸易有限公司]。(2)仪器：DU 640蛋白质核酸定量分析仪购自美国Beckman公司。ABI StepOne Plus反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)仪购自美国应用生物系统公司。

1.3方法

1.3.1基因组DNA提取与定量 对研究人群全血采用酚/氯仿抽提法抽提基因组DNA，后TE(Tris和乙二胺四乙酸缓冲液)溶解，DU640核酸蛋白分析仪测定计算DNA的含量，同时检测DNA样品的纯度，将每个标本稀释成20 ng/μL的应用液。

1.3.2SNP位点的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR分析 采用人基因组rs12097821(G/T)、rs2477686(G/C)、rs10842262(G/C)及rs6080550(C/T)SNP位点TaqMan探针分型试剂盒进行基因分型，PCR扩增体系为10.00 μL，含DNA模板1.50 μL、2×TaqMan Genotyping Master Mix 5.00 μL、40×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 0.25 μL、ddH2O 3.25 μL。ABI StepOne Plus RT-PCR仪进行PCR扩增，每96孔板设置3个空白对照(NTC)，反应条件为：95 ℃预变性10 min；92 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共40个循环。ABI StepOne Plus RT-PCR仪在上述PCR基础上进行等位基因识别分析，两个位点均设置FAM、VIC探针和样品孔、3个NTC空白对照，运用StepOne Software v2.1软件，读取荧光信号，通过X、Y轴散点图分析各样本的基因型。根据StepOne Software v2.1软件分析结果，对每种基因型随机选取样本进行测序验证，每个基因型选取2～3个样本，而对StepOne Software v2.1软件未能直接分型的样本，则直接测序。

1.4统计学处理 根据StepOne Software v2.1软件分析和测序结果确定样本的基因型，基因型频率和等位基因频率用直接计数法计算。应用SPSS17.0统计软件处理数据。组间基因型频率和等位基因频率比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。采用SNPstats软件对SNP位点进行连锁不平衡分析，SHEsis软件构建SNP单倍型并统计其频率分布。

2 结 果

2.1各个SNP位点基因型和等位基因频率统计分析 在对照组人群中4个SNP位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.064、0.170、1.000、1.000)，见表1、2。在检测的4个SNPs多态性位点中，rs2477686(G/C)、rs12097821(G/T)及rs6080550(C/T)基因型频率分布在疾病组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。疾病组rs2477686多态性位点C等位基因频率显著高于对照组(P<0.05)，疾病组rs12097821和rs6080550多态性位点的T等位基因频率也分别显著高于对照组(P<0.05)，而rs10842262位点基因型及等位基因频率分布在疾病组与对照组中的分布差异无统计学意义。另一方面，基因型频率结果显示rs2477686(C/C)、rs12097821(T/T)及rs6080550(A/A)分别增加人群中的NOA患病风险，OR值分别为2.64、2.61及13.52，且差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1 SNP位点基因型分布[n(%)]

续表1 SNP位点基因型分布[n(%)]

表2 SNP位点等位基因频率分布[n(%)]

2.2连锁不平衡分析与单倍型分析 由于rs2477686(G/C)、rs12097821(G/T)分别位于1号染色体短臂的3区6带和1区3带，故采用SNPstats软件对疾病组与对照组的上述2个SNPs位点进行连锁不平衡分析。结果显示，疾病组与对照组各位点之间存在连锁不平衡现象，且具有较强的连锁程度(D′=0.052，D′>0.05)。应用SHEsis软件对上述2个连锁不平衡的SNP位点构建单倍型并统计其在疾病组与对照组中的频率分布。结果 rs2477686与rs12097821构建的C-T单倍型频率分布在疾病组及对照组中差异具有统计学意义(P<0.001)，OR值为2.972，95%CI(1.645～5.372)。见表4。

表3 4个SNP位点基因型频率患病风险OR值[n(%)]

表4 1号染色体单倍型频率分布分析

3 讨 论

无精症的原因复杂多样，一般分为阻塞性无精症(obstructive azoospermia，OA)和NOA。综合各文献报道结果，NOA患者占男性不育者6%～26%。NOA是特发性男性不育的重要原因之一，其发病机制到目前为止不十分清楚，除去睾丸缺乏生精细胞外，大多无精症睾丸病理表现为生精停滞[13]。基于此，临床和科研人员投入大量的精力去研究无精症患者中精子发生相关基因的是否异常，以期找到发病的原因，从而达到干预治疗无精症的目的[14]。尽管早期研究发现Y染色体的微缺失可以直接导致NOA，然而越来越多的临床实践表明Y染色体的微缺失只是原因之一，其他许多遗传因素如影响精子发育的基因也与之相关[3-11]。

近年来，研究发现了许多与NOA相关联的基因如SPO11、EIF5A2、NR5A1、ART3、ZNF230、COX1O、MTHFR等，但研究都存在样本规模较小的问题，研究数据具有一定局限性，且所研究的基因与疾病的关联程度判断的主观因素大，存在很大的片面性[15-16]。目前这些研究的不足之处可以采用全基因组关联研究技术进行弥补。SNP作为人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上，位于基因调控区和精氨酸编码区可影响基因表达、引起蛋白结构改变、造成个体差异，已成为多基因疾病关联研究的热点。在一项NOA全基因组关联分析研究中，通过GWAS分析揭示了4种全新的中国人群NOA易感基因位点，该研究收集了中国男性人群2 927例NOA患者和5 734例健康对照，并且从906703个SNP位点中筛选确定分别位于染色体1p13.30、1p36.32、12p12.10和20p13.00的4个SNP位点，上述位点在NOA和正常群体存在显著性变异；该研究认为这些区域是导致NOA发生的遗传易感因素，而在这些区域中PRMT6、PEX10/MMEL1、SOX5和LOC100289473等相关基因可能与NOA关联最紧密[12]。但这些位点与无精症之间的相关性还不是十分明确，各个位点间的关联也不十分清晰。

本研究对贵州人群NOA与正常人群进行了上述相关的位点多态性研究，在检测的4个SNPs多态性位点中，rs2477686(G/C)、rs12097821(G/T)及rs6080550(C/T)基因型频率分布在贵州人群疾病组与对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。疾病组rs2477686多态性位点C等位基因显著高于对照组(P<0.05)，疾病组rs12097821和rs6080550多态性位点的T等位基因和A等位基因也分别显著高于对照组(P<0.05)，而rs10842262位点基因型及等位基因频率分布在疾病组与对照组中的分布无统计学差异。研究结果提示rs2477686、rs12097821及rs6080550位点多态性与贵州人群NOA可能存在一定的相关性，携带rs2477686 C等位基因、rs12097821 T等位基因及rs6080550 T等位基因者可能使NOA发病风险增加。

另一方面，连锁不平衡分析与单倍型分析结果显示：rs2477686与rs12097821构建的C-T单倍型频率分布在疾病组及对照组中差异具有统计学意义，提示单倍型C-T具有增加NOA的发病风险。而其他的单倍型频率组间差异均无统计学意义(P>0.05)，提示与疾病患病风险关联性较小。

本研究提示rs2477686、rs12097821及rs6080550位点多态性与贵州人群NOA可能存在一定的相关性，携带rs2477686 C等位基因、rs12097821 T等位基因及rs6080550 T等位基因者可能使NOA发病风险增加。rs12097821位点与PRMT6基因有关，而LUO等[17]最近发现PRMT6 能够被雄激素受体下调，并且调控生精细胞的迁移以及凋亡，从而推测出其能在精子发生过程中扮演者重要的角色。rs2477686与基因PEX10关联，CHEN等[18]发现果蝇PEX2与PEX10在果蝇的雄性生育中发挥至关重要的作用。rs6080550与基因SIRPA/SIRPG相关，LU等[19]发现SIRPA/SIRPG 的蛋白编码区的突变与NOA有关。

综上所述，上述这些3个SNP相关位点周围存在着与NOA发病相关的基因，提示和NOA的发病密切相关，但是确切的关系和发病机制仍有待于进一步的研究，而且SNP位点附近是否存在其他新的基因或者表达调控元件都值得进一步探索。这些研究的结果将为早期诊断和干预提供一定的依据和线索，以期最终达到减少不孕不育、提高人口素质的目标，具有重要的临床意义和社会意义。