气质联用结合多变量分析研究蜂蜜的挥发性成分

王文静，周雅莲，薛阿辉，屈亮亮，黄学勇*，罗丽萍,2

1南昌大学生命科学学院，南昌 330031；2南昌大学，食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜性物质[1]。不同来源蜂蜜的共性成分主要是糖类(70%～80% w/w)和水(10%～20% w/w)[2]，而蜂蜜产品的特殊性即风味、香味、颜色和质地主要取决于花蜜或植物的种类[3]。根据蜜源植物不同，蜂蜜分为单花蜜和杂花蜜[4]。单花蜜具有天然的特性和功效，在市场上广受消费者欢迎[5]。由于蜜源丰富，油菜蜜是稳产高产的蜂蜜品种之一，大约占蜂蜜总产量的40%左右。此外，椴树蜜、荆条蜜和洋槐蜜也是我国主要的蜂蜜品种，因蜜源来源限制，价格也高于油菜蜜。受高额利润的驱使，不法商家往往以次充好，通过掺入油菜蜜形成勾兑蜜，或用杂花蜜冒充单花蜜，欺骗消费者，这不仅降低了蜂蜜的质量，也严重干扰了蜂产品市场秩序[6-8]。为保障蜂蜜产品质量和市场秩序，需进行溯源技术体系的研究[9]。

蜂蜜的气味与蜜源关系密切，不同植物花蜜中挥发性物质的种类和含量不同，造成不同蜂蜜不同的气味特征，研究蜂蜜中的挥发性化合物对蜂蜜种类鉴别具有积极意义[10-13]。Alissandrakis等[14]认为某种化合物存在于所检测的所有单花蜜中，且不存在于其他蜂蜜或存在但含量较少时，该化合物可被看作该单花蜜的特征性化合物。Radovic等[15]采用动态顶空气相色谱-质谱联用技术分析了9种不同植物源的43个蜂蜜样品，认为存在二甲基二硫和同时不存在2-甲基-1-丙醇是欧洲油菜蜜植物源标记物；顺式芳樟醇和庚醛可作为洋槐蜜的标记物。然而，Plutowska[16]等采用顶空固相微萃取的气相色谱-质谱联用技术研究了波兰不同植物源蜂蜜发现二甲基二硫并非油菜蜂蜜的特有物质。Kaškoniene等[17]从11个油菜蜜中的6个样品中检出了二甲基二硫，但均未检出2-甲基-1-丙醇。由于单花蜜的挥发性物质和植物蜜源以及生存环境相关，一些挥发性物质可能存在于或不存在于同种蜜源中，但其出现频率比较高，在其它蜂蜜中未检出或含量较低时，也应将它确定为单花蜜的特征性挥发物[18]。大量研究表明，受内外因素的作用均会影响蜂蜜的化学组成，因此利用多种化合物和多元统计方法应更准确的鉴别不同蜜源蜂蜜[19 ]。

本文以油菜蜜、椴树蜜、荆条蜜和洋槐蜜为实验材料，采用静态顶空气相色谱-质谱联用技术(static headspace-gas chromatography-mass spectrometry,SHS-GC-MS)对其中的挥发性化合物组成进行鉴别，进一步采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚类分析(cluster analysis,CA)等多变量分析方法，对4种蜂蜜进行统计区分，并寻找特征变量和探讨它们的典型代谢物质，以期为蜂蜜溯源、品质和真伪鉴别提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜂蜜：共收集了4种蜜源的38份蜂蜜样品，具体信息见表1。样品由各地蜂农提供，4 ℃保存备用。C8-C40正构烷烃混标(美国AccuStandard公司)；正己烷(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)。

表1 蜂蜜样品信息表

1.2 仪器与设备

GC7890B-MS7000C气相色谱-质谱联用仪，配置7697A顶空进样器(美国Agilent公司)、HP-5ms色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；BSA224S型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；DKZ-450B型电热恒温振荡水槽(上海森信实验仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 SHS-GC-MS实验条件的优化

参考Kaskoniene和Siegmund等[17,21]的报道，对影响SHS-GC-MS检测结果的主要因素，包括平衡时间、平衡温度、样品量、分流比等进行了优化，以匹配度>75%的有效峰个数为评价指标，获得最佳实验条件。

1.3.2 SHS-GC-MS检测蜂蜜中的挥发性成分

将待测蜂蜜样品置于45 ℃水浴中加热20 min，混匀样品，准确称取13.00 g蜂蜜加入20 mL顶空瓶中，压紧瓶盖密封，置于样品盘。正构烷烃标准品用正己烷稀释至1 mg/mL待测。

顶空瓶加热温度80 ℃，样品平衡20 min，定量环温度100 ℃，传输管温度120 ℃，进样环体积1 mL，进样时间1 min。

GC条件：气化室温度250 ℃，柱温为初始温度40 ℃(保持2 min)，以8 ℃/min升温至250 ℃，分流模式进样，分流比5∶1，氮气流速1 mL/min。MS条件：EI电离方式，电子能量为70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质谱扫描模式定性，扫描范围m/z30～500，溶剂延迟1.5 min。

1.4 数据分析

分离的挥发性化合物的鉴定通过仪器自带的NIST14和Flavor4数据库检索，结合正构烷烃标准品计算保留指数(Kova’ts retention indices,KI)，并与质谱库中的保留指数比对进行定性分析。峰面积归一法获得各挥发性成分的相对含量。使用Matlab R2016a(美国Mathworks公司)和SPSS 22.0(IBM SPSS statistics)软件对数据进行主成分分析(PCA)和聚类分析(CA)。

2 结果与分析

2.1 SHS-GC-MS实验条件的优化结果

为获得更丰富的挥发性物质，本文对样品量(2.00、7.00、13.00 g)、平衡时间(10、20、30 min)、平衡温度(60、70、80 ℃)、分流比(不分流、5∶1、10∶1)进行了对比优化，比较结果如图1所示。结果表明，平衡时间20 min，平衡温度80 ℃，样品量取13.00 g和分流比为5∶1时获得匹配度>75%的色谱峰数目最多。

图1 不同实验条件对蜂蜜挥发性成分色谱峰数目的影响Fig.1 Effects of different experimental conditions on the number of peaks of volatile components in honey

2.2 蜂蜜挥发性成分的SHS-GC-MS分析

利用SHS-GC-MS从38份蜂蜜样品中检测到23种化合物(见表2)。不同蜜源蜂蜜物质组成和相对含量之间存在差异。 4种蜂蜜中都检出了苯乙醛(38个样品中有19个样品检出)和邻苯二甲酸二异丁酯(38个样品中有25个样品检出)，且苯乙醛(32.72%)平均相对含量高于邻苯二甲酸二异丁酯(5.53%)。

在17份油菜蜜中共检测出16种挥发性物质，3-苯丙酸乙酯(14)和2-甲基丁醇(12)是在样品中检出较多的物质(括号中的数字表明检出该物质的样品数，以下同)，3-苯丙酸乙酯在其他蜂蜜中未检出，而在油菜蜜中出现频率比较高，可作为油菜蜜的典型代谢物，Seisonen等[20]也从产于爱沙尼亚的帚石南蜜和油菜蜜中检出了这种物质。Siegmund等[21]的报道也同样检测到了乙酸、苯甲醛和苯乙醛等物质。油菜蜜中平均相对含量较高的物质依次是乙酸乙酯(56.12%)、2-甲基丁醇(10.48%)和乙酸(4.71%)。与其他几种单花蜜相比，油菜蜜中缺乏反式玫瑰醚，脱氢芳樟醇等，这作为油菜蜜的特征之一，与文献报道相一致[16]。

在8份椴树蜜中共检测出9种挥发性物质，平均相对含量较高的物质依次是1-异丙烯基-3-甲基苯(10.46%)、反式玫瑰醚(9.35%)和苯乙醇(3.31%)，其中1-异丙烯基-3-甲基苯(8)和反式玫瑰醚(6)在其他单花蜜中未检出且频率相对较高，可作为椴树蜜的典型物质。裴高璞[22等的研究认为反式玫瑰醚是椴树蜜的特有成分。

在8份荆条蜜中共检测出12种挥发性物质，这12种物质均在其他蜂蜜中检出，其中苯乙醛存在于所有荆条蜜中，含量高达(56.99%)，然而其他三个蜜种的11个样品中也有检出，因此未发现荆条蜜的典型代谢物质。

在5份洋槐蜜中共检测出7种物质，其中邻苯二甲酸二异丁酯和苯甲醛存在于所有洋槐蜜样品，但前者在其他三个蜜种的20个样品中，后者在5个荆条蜜和2个油菜蜜样品中也有检出，因此同样未发现典型代谢物质。洋槐蜜中平均相对含量较高的物质依次是乙酸乙酯(24.66%)、邻苯二甲酸二异丁酯(16.29%)和(S)-氧化芳樟醇(7.25%)。

我们还发现了部分成分仅出现在某一两个蜂蜜样品中，如(1S,4S,4aR)-4-异丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4A,7-六氢萘(2.04%)、乙酸叶醇酯(2.45%)和辛酸乙酯(0.10%)等，且含量相对较低，可能与蜂蜜的污染或发酵等有关[23]。

表2 SHS-GC-MS检测不同蜂蜜样品的挥发性物质组成

续表2(Continued Tab.2)

编号No.RT化学式Chemical formula化合物CompoundsKI相对含量Relative percent(%)油菜蜜(n=17)Rape honey椴树蜜(n=8)Linden honey荆条蜜(n=8)Chaste honey洋槐蜜(n=5)Acacia honey1310.59C10H122,4-二甲基苯乙烯a,bBenzene,1-methyl-4-(1-methylethenyl)-1 096NDND0.21～2.47 (4)ND1410.84C8H14O2乙酸叶醇酯a,b3-Hexen-1-ol,acetate,(Z)-1 1102.45 (1)NDNDND1510.86C10H16O脱氢芳樟醇a,bHotrienol1 110ND6.46～11.85 (3)1.58～6.25 (4)ND1610.98C10H18O反式玫瑰醚a,btrans-Rose oxide1 117ND3.85～24.20 (6)NDND1711.13C8H10O苯乙醇a,bBenzeneacetaldehyde1 123ND0.62～7.90 (4)0.24～0.85 (4)2.50～3.21 (2)1812.18C9H10O2苯甲酸乙酯aBenzoic acid,ethyl ester1 1930.10～0.40 (7)NDNDND1912.58C10H20O2辛酸乙酯aOctanoic acid,ethyl ester1 2010.10 (1)NDNDND2013.74C10H12O2乙酸苯乙酯a,bAcetic acid,2-phenylethyl ester1 2661.30～3.20 (8)10.88～18.60 (2)0.85～4.32 (2)ND2115.32C11H14O23-苯丙酸乙酯a,bBenzenepropanoic acid,ethyl ester1 3590.30～1.71 (14)NDNDND2219.39C15H24(1S,4S,4aR)-4-异丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4A,7-六氢萘aCubenene1 6232.04 (1)ND2.05 (1)ND2322.84C16H22O4邻苯二甲酸二异丁酯a,b1,2-Benzenedicarboxylic acid,bis(2-methylpropyl) ester1 8830.28～12.51 (11)4.02～4.44 (2)0.55～4.50 (7)0.87～26.13 (5)

注：a:GC-MS鉴定;b:NIST谱库检索鉴定;KI:根据正构烷烃计算的保留指数;ND:未检测到;括号内数值为该物质检出样本数。

Note:a:Identification by GC-MS;b:Identification according to NIST Mass Spectral Library;KI:Kova’ts retention indices calculated by n-alkanes;ND:not detected;The value in brackets indicates the number of samples detected.

2.3 主成分分析和聚类分析

利用Matlab R2016a软件对4种不同蜜源的38份蜂蜜样品的气相匹配数据进行PCA分析，计算特征值、特征向量以及累计贡献率。 图2(A)，2(B)是PCA 得分图，PC1、PC2 和 PC3 分别代表了变量总方差的41.0%、20.6%和15.7%，累积贡献率达77.3%，包含了分析样品的绝大部分信息。图2(C)是PCA分析相应的载荷图，其中贡献较大的物质有乙酸乙酯，苯乙醛，1-异丙烯基-3-甲基苯，反式玫瑰醚，邻苯二甲酸二异丁酯，苯乙醇，脱氢芳樟醇和乙酸苯乙酯等。PCA二维图和三维图表明，不同蜜源之间可以很好地区分。结果表明，SHS-GC-MS结合PCA可以有效区分4种不同蜜源蜂蜜。

图2 4种不同蜜源蜂蜜的38份蜂蜜样品的PCA得分图(PC-2维图(A)、PC-3维图(B))和载荷图 (C)Fig.2 Score plots ( (A) principal component PC-two-dimensional,(B) PC-three-dimensional ) and loading plots (C) of 38 honey samples from 4 different honey sources by principal component analysis

利用SPSS 22.0软件对4种不同蜜源的38份蜂蜜样品的气相匹配数据进行CA分析，采用平方Euclidean距离测量方法，结果如图3所示。当临界值为10时38份蜂蜜样品被分为4类，不同蜜源的蜂蜜可以很好的分别各自聚为一类。聚类分析结果与PCA分析结果一致，结果表明，SHS-GC-MS结合CA的方法有效，分类正确率达到了100%。

图3 4种不同蜜源蜂蜜的38份蜂蜜样品的CA树形图Fig.3 Dendogram of 38 honey samples from 4 different honey sources by cluster analysis

3 结论

本文采用优化的SHS-GC-MS从4种蜂蜜中共鉴定出23种化合物，其中3-苯丙酸乙酯可作为油菜蜜的典型代谢物，1-异丙烯基-3-甲基苯和反式玫瑰醚可作为椴树蜜的典型代谢物，荆条蜜和洋槐蜜未发现典型代谢物。由于蜂蜜的化学组成极其复杂，不仅受蜜源影响，同一种蜜源产地不同，甚至同一产地在不同气象条件下，也会导致蜂蜜化学组成的变化，所以，单一的挥发性物质很难将不同蜜源的蜂蜜分开，基于多变量分析的PCA和CA有助于对不同蜜源蜂蜜样品进行区分。采用SHS-GC-MS结合多变量分析为蜜源挥发性物质组成和蜂蜜溯源、品质提供了理论依据和技术支撑。