亚硝态氮对中华鳑鲏的急性毒性及短期影响

2019-05-30胡春风洪奥博

水产科学 2019年3期

封琦，胡春风，洪奥博，薛松，嵇元，王权

(江苏农牧科技职业学院水产科技学院，江苏泰州 225300 )

亚硝态氮作为氮循环中氨态氮向硝态氮转化的中间产物，广泛存在于水生态系统中。相对于陆生动物，鱼类受亚硝态氮影响较大，这是因为鱼鳃上皮细胞可以自周围水体中主动吸收亚硝态氮，并累积在体液中。亚硝态氮主要影响鱼体的离子调节、呼吸、心血管、内分泌以及排泄功能[1]。精养体系(主要是水体交换量很少的静水和循环水模式)中，亚硝态氮的累积会对养殖对象产生应激作用，造成生长缓慢乃至大量死亡[2-5]。

中华鳑鲏(Rhodeussinensis)是我国(除黑龙江水系外)广泛分布的淡水鱼类，本身具有较高的观赏价值[6]，同时可以与其他水产经济动物混养以提高经济效益[7-10]，而且可对养殖水体环境变化进行生物预警[11-13]。笔者以中华鳑鲏为研究对象，对亚硝态氮急性毒性及短期胁迫条件下，中华鳑鲏血清中过氧化氢酶和碱性磷酸酶的活性变化进行研究，旨在为中华鳑鲏生态套养模式中的水质管理提供科学建议。

1 材料与方法

1.1 材料

中华鳑鲏取自江苏农牧科技职业学院水产实训中心，试验前暂养于1.0 m×0.6 m×0.5 m的水族缸中两周。试验期间，正常投喂配合饲料，每日虹吸清除底部残渣，水温(25±1) ℃，pH 7.4±0.1，溶解氧(6.3±0.6) mg/L。挑选健康、活跃个体[体质量(0.636±0.09) g，体长(3.9±0.39) cm]用于试验。

过氧化氢酶测定试剂盒、碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，NaNO2为国产分析纯。

1.2 试验设计

采用静水法进行急性毒性测试，在预试验的基础上，设置6个质量浓度组(6、10、11、14、16.6、18 mg/L)和1个空白对照组，每组3个平行。不同质量浓度的测试液均采用超纯水(pH约7.4)添加适量NaNO2制备而成，每组水量10 L。每个质量浓度组随机加入20尾活力良好的中华鳑鲏，24 h后计数死亡个体数。

根据急性毒性试验结果，设置高、中、低3个处理组，分别为24 h 半致死质量浓度的1/10、1/20、1/30，每个处理组设3个平行，保持试验期间水中亚硝态氮质量浓度稳定；在0(试验开始前)、24、48、72 h 4个时间点各随机取出5尾，采用1 mL无菌注射器围心腔取血，合并置于无菌离心管中，3500 r/min离心10 min, 取上层血清，立即测定过氧化氢酶、碱性磷酸酶活性。

1.3 数据分析

急性毒性数据采用概率单位法分析；对酶活性数据先进行Shapiro-Wilk正态性检验和Levene′s方差齐性检验；当上述条件均满足后，采用双因素方差分析因子主效应(固定因子为亚硝态氮质量浓度和暴露时间)，对交互作用进行简单效应分析[14]；若未满足上述参数统计检验条件(数据正态性和方差齐性)，则先进行数据转换[15]；若实在无法满足参数统计条件(数据转换后，仍无法满足上述参数检验条件)，则运用Dunnett′s C非参数检验进行多重比较，所有计算均采用统计软件SPSS 24.0完成。

2 结果与分析

2.1 亚硝态氮对中华鳑鲏的急性毒性

试验中观察到鱼狂躁不安，出现体表充血、死亡现象。根据24 h急性毒性试验结果(表1)，计算得到亚硝态氮对中华鳑鲏24 h半致死质量浓度为12.76 mg/L。

表1 亚硝态氮对中华鳑鲏的急性毒性效应试验结果

2.2 亚硝态氮对中华鳑鲏血清过氧化氢酶活性的影响

双因素方差分析结果表明，亚硝态氮暴露时间对过氧化氢酶活性作用影响极显著，并且亚硝态氮质量浓度和暴露时间两者间存在极显著的交互作用。因亚硝态氮质量浓度对过氧化氢酶活性作用影响不明显，后期简单效应分析仅检测在不同亚硝态氮质量浓度水平上的暴露时间效应。3个质量浓度组过氧化氢酶活性变化大致相同，随着暴露时间延长均呈现先升后降的趋势，在第48 h过氧化氢酶活性达到峰值(显著高于各自对照组)，并且随着亚硝态氮质量浓度增加而升高(图1)。

图1 亚硝态氮对中华鳑鲏血清过氧化氢酶活性的影响图中不同字母表示差异显著(P<0.05).下同.

2.3 亚硝态氮对中华鳑鲏血清碱性磷酸酶活性的影响

数据预处理发现碱性磷酸酶活性数据还缺方差齐性条件，对数转换后可以满足参数统计条件，因此后续统计分析中均采用转换后的数据。双因素方差分析结果表明，亚硝态氮质量浓度和暴露时间均会对碱性磷酸酶活性造成极显著的影响，并且两因素之间存在极显著的交互作用。3个质量浓度组碱性磷酸酶活性在24 h均显著下降，在48 h呈回升趋势，此后在72 h再次明显下降(图2a)。在24 h碱性磷酸酶活性亚硝态氮质量浓度升高呈显著下降趋势，在72 h 0.64、1.28 mg/L组酶活性均显著低于0.43 mg/L组(图2b)。

图2 亚硝态氮对中华鳑鲏血清碱性磷酸酶活性的影响

3 讨论

3.1 亚硝态氮对中华鳑鲏的急性毒性

亚硝态氮含量超标是集约化高密度水产养殖常遇到的问题[16]。淡水鱼类鳃部能够通过与氯离子竞争自外界环境中主动吸收亚硝酸根离子，水环境中亚硝态氮的累积会对淡水鱼类造成潜在危害。亚硝态氮在鱼体内累积的主要毒害作用是将血红蛋白中的亚铁离子氧化成高铁离子，从而抑制或降低血液供氧能力[17-18]。

本次试验发现，在水温25 ℃、pH 7.4、溶解氧6.3 mg/L的条件下，亚硝态氮对中华鳑鲏的24 h半致死质量浓度(12.76 mg/L)要低于此前报道的高体鳑鲏(R.ocellatus)鱼苗(97.05 mg/L)[19]、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)(372.59 mg/L)[20]、鳙鱼(Aristichthysnobilis)(411.20 mg/L)[20]、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)(201.88 mg/L)[21]、暗纹东方鲀(T.obscurus)(202 mg/L)[22]、麦穗鱼(Pseudorasboraparva)(422.862 mg/L)[23]。亚硝态氮对水生生物的毒性受多种内外因素共同作用，其中最重要的影响因子有水质(包括pH、温度、阳离子、阴离子及溶解氧)、暴露时间、鱼种及个体敏感性差异等[24-25]。试验所采用的温度和pH条件参考了已有的研究报道，pH、水温和溶解氧也符合淡水鱼类正常生长要求，排除了主要外在因素的干扰(氯离子和其他可能产生干扰的离子)，试验结果具有一定的可比性。结果表明，中华鳑鲏对亚硝态氮比较敏感。

3.2 亚硝态氮对过氧化氢酶活性的作用

亚硝态氮通过血液扩散到红细胞中发挥作用，血液是其在鱼体中的主要靶位点[26-27]。已有报道表明亚硝态氮会诱发水生动物产生氧化应激[2,28]。因此本次试验以血清为样本，对其抗氧化酶活性进行分析。过氧化氢酶作为鱼类抗氧化酶系统的一种关键酶类，在氧化应激时通过清除过氧化氢对机体起保护作用[29]。本研究发现，在亚硝态氮胁迫下，过氧化氢酶活性在亚硝态氮各质量浓度组均呈先升后降的趋势，该结果与在日本蟳(Charybdisjaponica)和罗氏沼虾(Macrbrachiumrosenbergii)中的观察结果一致[30-31]。这可能是因为亚硝态氮短期胁迫会上调过氧化氢酶的表达量；但随暴露时间的延长，机体产生的过量活性氧对脂类和蛋白造成氧化损伤，从而导致过氧化氢酶活性下降[31-33]。此外，统计分析结果表明，亚硝态氮质量浓度对过氧化氢酶活性影响不显著，这说明过氧化氢酶活性对亚硝态氮质量浓度变化不敏感。

3.3 亚硝态氮对碱性磷酸酶活性的影响

Xu等[34]研究了日本沼虾(M.nipponense)在急性和慢性亚硝态氮胁迫下的转录组变化，发现亚硝态氮对免疫相关的信号通路有不同程度的激活作用。碱性磷酸酶作为一类最重要的溶酶体酶，在免疫防御和细胞内氧气运输方面均起着关键作用[35]。本研究发现，在亚硝态氮胁迫下，各质量浓度组碱性磷酸酶活性均呈先降后升再下降的趋势，该结果与日本沼虾的研究报道一致[36]。这可能因为碱性磷酸酶活性对亚硝态氮刺激反应比较敏感，短时间内(24 h)机体免疫能力受到抑制；但随着机体免疫信号通路的打开，产生生理性代偿作用，酶活性在48 h出现短暂恢复；此后随暴露时间延长，机体受到损伤、免疫代谢平衡被打破，导致酶活性再次出现下降[37-39]。