贵州都匀一种聚筛蕊地衣粗多糖的提取及抑菌活性初探

孟庆峰，张 柳， 杨彩玲，周 璇，付少彬

(1.遵义医科大学 公共卫生学院食品基础教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 药学院药物化学教研室，贵州 遵义 563099)

地球生物圈内生态系统中地衣型真菌与相应的藻类或蓝细菌结成稳定的胞外共生的生态群落[1]。地衣因其独特的生长环境，生长过程中能产生一些独特的化学物质，初生代谢产物中地衣多糖往往表现出良好的生物活性，次生代谢产物主要有缩酚酸类及其衍生物、蒽醌、萜类、脂肪酸及甾体类，这些独特的化学物质使地衣的食药用价值不同于植物[2]，地衣以及地衣共生菌种结构新颖的化合物也报道的越来越多[3-4]，地衣具有抑菌、抗辐射、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等方面的作用[5-8]，魏江春曾经在《中国药用地衣》中收录71种药用地衣，结合民间调查，杨美霞等人列出了130多种药用地衣，由此可见，中国的中医、药学博大精深、源远流长[2]。此外，地衣在沙漠治理等方面具有很高的应用价值，地衣在土壤或岩石表面的覆盖可以有效阻止水分的蒸发，并有利于水分在岩石表面的蓄积，这为苔藓及种子植物的生长提供了最基本的条件[9]，这其中地衣的菌丝组织以及其中的多糖等物质功不可没。地衣多糖是地衣中一类重要的活性成分，石耳地衣多糖具有抗氧化的作用，从一种裸缘梅衣Parmotremamantiqueirense中提取的多糖经硫酸化以后具有了比较好的抗血栓、抗凝血的作用，地衣多糖能够明显提高免疫抑制小鼠的免疫功能，树花多糖有较强的还原力，能有效抑制.OH、O-.[10-12]。

聚筛蕊Cladiaaggregate(Sw.)Ny1隶属于石蕊科Cladeaceae，筛蕊属Cladia[13]，以全草入药，其中只含有巴巴酸，从聚筛蕊地衣中分离出19种化学成分，主要为烯烃醇、醛、酮和呋喃等含氧挥发性化学物质，聚筛蕊对重金属镉和汞有富集作用[14]，而聚筛蕊多糖的提取和活性研究少见报道。

本研究对采自贵州都匀斗篷山景区的聚筛蕊地衣进行形态学鉴定，采用热水浸提法和乙醇沉淀法提取聚筛蕊地衣中的粗提物，通过苯酚硫酸法计算粗提物的含量，最后用琼脂扩散法研究粗提物的抑菌性情况，为该地区聚筛蕊地衣资源开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 分析天平(FA2004N，上海菁海仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-6，郑州长城科工贸有限公司)；医用离心机(H1650-W，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；酶标仪(RT6500，BIO-RAD公司)；立式压力蒸汽灭菌器(BXM-30R，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；旋转蒸发仪(RE52CS，上海亚荣生化仪器厂)；体视显微镜(SMC-745，上海巍途光电技术有限公司)；超净工作台(VS-1300L-U，苏净安泰)；精密鼓风干燥箱(BPG-9140A型，上海齐欣科学仪器有限公司)。

1.2 地衣体和菌株 聚筛蕊地衣体采自贵州省都匀市斗篷山景区的茅草坡，海拔950 m，生长于土壤表层。实验菌株保存在本实验室，见表1。

表1主要菌株

序号菌种名称编号1铜绿假单胞菌ATCC 278532大肠埃希氏菌ATCC 259223金黄色葡萄球菌ATCC 65384鼠伤寒沙门菌ATCC 140285藤黄微球菌CMCC 280016金黄色葡萄球菌ATCC 259237宋氏志贺菌CMCC 515928白色念珠菌ATCC 102139大肠杆菌ESBL 1302510表面葡萄球菌ATCC 12228

1.3 药品试剂 实验中主要的试剂见表2。

表2主要试剂

序号试剂名称规格生产厂家1无水乙醇AR成都市科龙化工试剂厂2苯酚AR成都金山化学试剂有限公司3硫酸AR成都市科龙化工试剂厂4青霉素V钾片0.239 g(40万单位)通药制药集团股份有限公司5硫酸庆大霉素颗粒10 mg(1万单位)葵花药业集团(衡水)得菲尔有限公司6无水葡萄糖AR成都市科龙化工试剂厂7NaClAR成都市科龙化工世纪厂8LB培养基250g上海博微生物科技有限公司

1.4 方法

1.4.1 聚筛蕊地衣的形态学鉴定 将地衣置于光学体视显微镜下，观察并记录地衣体的类型、颜色、粉芽、裂芽、子囊盘的有无及形状、直径、着生方式、分枝状况等形态特征。

1.4.2 聚筛蕊地衣粗多糖的提取 将聚筛蕊地衣用清水浸泡2 min，然后置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎后准确称量1 g聚筛蕊地衣样品于烧杯中并按料液比(地衣体：水)1∶30(m:v)，放于80 ℃恒温水浴锅中提取3 h， 4 000 rmp离心5 min后取出上清液，恒温浸提3次，合并上清液，减压浓缩后用无水乙醇沉淀，乙醇终浓度为70%，4 ℃冰箱沉淀24 h后离心得粗多糖，50 ℃干燥称粗多糖重量。

1.4.3 粗提物含量的测定 多糖含量测定选用常规的苯酚-硫酸法。

1.4.4 聚筛蕊地衣粗多糖抑菌试验 供试菌株的活化和菌悬液制备：将菌株在液体肉汤培养基中摇床培养24 h进行活化，然后用无菌水稀释成105CFU菌悬液，待用。

样品制备：将粗多糖样品制备成2.5 mg/mL的溶液。青霉素V钾和硫酸庆大霉素制备成1 mg/mL溶液作为阳性对照溶液，备用。

抑菌实验：用无菌棉签沾取供试菌菌悬液，在LB培养基固体平板上轻轻涂匀，待表面稍稍干燥后，用6 mm打孔器均匀打3个孔，吸取少量融化状态的无菌固体培养基，滴于小孔，待冷却后密封底部。用移液器分别向3孔移取80 μL样品、阳性对照和无菌水作为阴性对照。37 ℃正置培养24 h，观察抑菌圈的有无及大小。

2 结果

2.1 地衣体形态学鉴定 地衣体为枝状，土壤生，直立丛生，颜色主要呈褐绿色或少许褐色，二叉式或不规则分枝，分枝稠密，无粉芽和裂芽，中空圆柱状，筛孔直径在0.5～2 mm，分枝表面光滑有光泽，枝腋间主要呈椭圆形，无子囊盘，地衣果柄顶端呈黑褐色，高3.5～7 mm。该地衣为聚筛蕊地衣，显微镜下图片见图1。

图1 体视显微镜下聚筛蕊形态

2.2 粗多糖的含量 通过热水提取，乙醇沉淀得到的粗多糖为白色略带黄色的不定性粉末(见图2)，由公式：提取率=(粗多糖质量/聚筛蕊地衣质量)×100%，得出粗多糖的提取率为2.14%。通过葡萄糖的标准曲线，得出回归方程y=0.691x-0.2064，相关系数R2=0.9948。根据测得的吸光度值,计算得出地衣多糖的粗多糖含量为19.64 mg/g。

图2 提取的聚筛蕊粗多糖

2.3 抑菌实验结果 实验结果显示，聚筛蕊地衣粗多糖对10株供试菌株均未显示明显的抑制活性，部分结果见图3，除了阳性对照药，琼脂平板培养基中没有抑菌圈，说明聚筛蕊粗多糖对所提供的供试菌没有抑菌效果。

图3 粗多糖抑菌试验结果

3 讨论

地衣作为第一个登陆的先锋生物，在长期不断进化过程中，拥有较强的环境适应能力，尤其是抗逆能力，极冷、极热、极干燥、强紫外线等件下均能保持旺盛的生长，这些逆性环境造就了地衣体内成分的复杂性和功能的多样性，本研究以聚筛蕊粗提物做抗菌活性研究，以期筛选抗临床致病菌和耐药菌的活性多糖，结果显示聚筛蕊对筛选的致病菌未显示出抗菌活性，可能与其化学成分较为单一有关，文献报道其地衣成分中以巴巴酸为主[13]。聚筛蕊地衣多糖虽然在抗菌方面未显示出明显效果，但地衣多糖在调节免疫功能方面也很有优势[15]，冰岛衣中的β-1,3/1,4-葡聚糖能够诱导人角质形成细胞分化[16]。聚筛蕊地衣多糖可能也会表现出其他方面的活性，如抗氧化、抗癌等，在后续研究中我们也会开展地衣多糖更广泛的活性研究。由于聚筛蕊在斗篷山地区有较为明显的生长优势，在众多地衣种类中，属于数量较多的一个类群，开展其成分的活性筛选研究可以为地衣资源的开发及利用提供参考，具有深远的意义。