卒中后抑郁动物模型的造模方法

蒋文霞 牟君

近年来,随着人口老龄化进程的加快,脑卒中的发病率也随之升高。据美国心脏协会统计,仅2015年全球脑卒中患者已达4240万[1]。脑卒中的并发症主要包括运动障碍、感觉障碍、认知障碍、卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)及自主神经功能紊乱等。其中,脑卒中患者PSD的发病率为28.5%～85.0%[2-4]。PSD以情绪低落和兴趣下降为核心临床表现,不但影响患者神经功能缺损症状的恢复,降低康复治疗效果,还可通过影响患者认知功能而显著降低生活质量。目前其发病机制尚不清楚,缺乏预测发病和判定预后的客观生物学指标。建立标准化的PSD动物模型对于发病机制及治疗的研究尤为重要。现就目前PSD动物模型的建模流程及常用方法进行总结。

1 动物选择

PSD动物模型常选用大鼠及小鼠,大鼠种类包括SD大鼠[5-12]及Wistar大鼠[13-15],小鼠种类包含 C57BL/6 小 鼠[16-19]、balb/c 小 鼠[20-22]、Laca strai小鼠[23-24]、CD-1小鼠[25]、ICR小鼠[26]。目前各实验室采用最多的动物为SD大鼠,其次为C57BL/6小鼠,CD-1小鼠及ICR小鼠的使用相对较少。动物的选择以雄性为主,周龄及体重则根据动物种类不同而各异。通过检索文献,将目前常用动物的种类、性别、周龄及体重范围进行汇总,结果见表1。

表1 常用PSD造模动物种类、性别、周龄及体重

2 预适应

动物实验前需进行预适应。各实验室均采用12 h/12 h昼夜周期节律及自由饮食饮水,但在预适应温度、湿度、每笼饲养动物数量及适应时间上各有不同。最常用的温度范围为19～23℃,湿度范围为55%～65%,饲养条件为2只/笼。预适应时间以7 d或14 d最常见。

3 卒中模型制备方法

3.1 大脑中动脉永久性闭塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO)p MCAO是目前采用最多的卒中动物模型。因为不用拔出线栓,故最能模拟人类缺血性卒中的发病过程,成功率高,死亡率低。

3.2 大脑中动脉缺血再灌注(ischemic reperfusion of cerebral middle artery)缺血再灌注模型对小鼠适用,因需拔除栓塞,实验操作难度相对较大,对实验操作者要求较高。

3.3 大脑中动脉开颅电凝法开颅电凝法可造成模型动物皮层缺血,其缺血部位、大小恒定,模型大鼠偏瘫程度轻,但开颅手术会破坏血-脑屏障,引起脑脊液漏及脑组织损伤,感染几率增加,手术难度较大。

3.4 大脑中动脉自体血栓塞法自体血栓塞法无需插入或拔除线栓,可更好地模拟自体血栓所致大脑中动脉栓塞过程,但栓子栓塞的部位、大小不固定。

3.5 双侧颈总动脉永久闭塞法(permanent bilateral common carotid artery occlusion,pBCCAO)双侧颈总动脉结扎法操作简单,建模成功率较高,但动物术后瘫痪较重,不利于药物疗效观察及机制研究。

3.6 双侧颈总动脉缺血再灌注法(ischemic reperfusion of bilateral common carotid artery)相对于大脑中动脉缺血再灌注法,双侧颈总动脉缺血再灌注操作简单,动物损伤小,死亡率低,模型成功率高,缺血和再灌注时间易于控制,能很好模拟脑梗死再灌注时脑组织病理生理演变,但模型欠稳定。

3.7 局部皮质光栓塞法利用感光物质可在光照下使局部血管内皮损伤及血小板聚集的原理,可根据需要建立特定皮质区域的栓塞,栓塞部位相对固定,无需开颅,操作简单,避免了手术对动物脑组织及血管的机械损伤,对动物全身影响较小,有较高的可重复性和较低的死亡率。但该模型的栓塞多发生于终末动脉,近似于人类的微血管病变,不能用于解释人类大脑中动脉栓塞的发病机制。

目前各卒中模型以p MCAO模型为主,其次为大脑中动脉缺血再灌注模型,而开颅电凝法、自体血栓塞及光栓塞法应用相对较少。

4 PSD模型建立方法

大多数PSD模型是在卒中模型的基础上经过孤养、慢性温和不可预知应激(CUMS)建立而成。目前各实验室采用的CUMS模式有14种之多,不同实验室选用的应激组合方案不同。现通过检索文献对采用的CUMS模式及其使用情况进行总结,结果见图1。

5 行为学评价

5.1 卒中行为学评价

5.1.1 神经功能评分(m NSS):m NSS评分为0～18分,0分为正常,最高评分18分。m NSS通过运动、感觉及反射来评价大鼠神经功能缺损的严重程度,分数越高则提示动物神经功能损伤越重。m NSS评价相对全面,但方法较复杂,操作难度大。

5.1.2 The foot-fault test:该法通过记录大鼠前爪足误的次数来评价其神经功能损伤,较为常用,操作简单,易执行。运用该法对动物进行神经功能评价时,双侧的错误步数均需记录,统计双侧错误步数的差值,以消除不同大鼠活动程度的影响。

5.1.3 Modified grip-traction test:该法通过记录动物从绳子上掉下来的时间和将损伤侧后肢拉上绳子的能力,客观评价前爪抓握能力和肌力。是目前唯一用于测量动物卒中后肌力的方法,但尚缺乏具体的量化指标,使用较少,其评价的准确性及有效性有待进一步验证。

5.1.4 Inclined beam-walking test:测试动物通过斜木棒的能力,以评价其前后肢的协调性,用于有运动缺损的动物模型,若为皮层局部损伤而缺乏运动障碍的模型则不适用于该法。

5.1.5 Longa评分:记录卒中后动物行走时向手术对侧倾斜的情况,是目前各卒中模型使用最多的一项评分方法,简单易行,能较快挑选出符合实验要求的动物。但该测试方法较主观,评估的精确度有待进一步研究证实。

图1 各种CUMS刺激模式及文献使用情况汇总

5.1.6 Bederson评分:通过提尾及侧推观察卒中动物前肢屈曲情况,利用动物的姿势反射在悬尾状态下,检查动物上半身姿势。在国内外各文献中应用频率较高,具有较好的可操作性和稳定性,但缺乏感觉功能评定。

5.2 抑郁行为学评价

5.2.1 糖水偏好试验(sucrose preference test,SPT):SPT是目前较经典的抑郁行为评价方法,利用大鼠对蔗糖水的嗜好,模拟人类的兴趣感。若PSD大鼠的蔗糖水饮用量下降则可模拟PSD患者以兴趣感下降为核心的抑郁症状。

5.2.2 旷野试验(open field test,OFT):OFT主要用于评估动物的探索性及焦虑行为。动物对新开阔环境的恐惧主要在周边区域活动,在中央区域活动较少,但动物的探究特性又促使其在中央区域活动的动机,若动物在旷野中心持续时间减少,提示动物兴趣感下降。

5.2.3 强迫游泳实验(forced swim test,FST):FST利用实验动物无法逃出困境的绝望产生抑郁,但有部分研究者认为,实验动物在FST中的静止状态可能只是一种适应或疲劳现象,而不是真正的绝望行为,因此该评价方法有待进一步验证。

5.2.4 水迷宫实验(Morris water maze test):水迷宫实验广泛用于评价老鼠的认知功能,认知功能主要与海马相关,而大多数PSD模型是在卒中模型的基础上建立而成,损伤的主要结构是大脑皮层,故其评价的准确性尚存在一定争议。

5.2.5 Passive avoidance test:该测试通过记录实验动物由明室进入暗室的时间来评估动物的认知功能,其缺陷与水迷宫实验相同,损伤的结构与动物的学习区不存在直接联系,评价的准确性存在争议。

5.2.6 悬尾试验(tail suspension test,TST):TST通过记录老鼠悬尾状态下的静止时间来判断其抑郁情况,与FST相似,均利用老鼠无法逃脱困境产生抑郁,但TST的静止不动是一种适应还是绝望有待进一步验证。

综上所述,PSD的建模流程包括动物选择、预适应、卒中模型制备、卒中后抑郁模型建立及行为学评价5个步骤。由于各个实验室自身选择及条件不同而使PSD造模各步骤存在一定差异,尚无统一标准。目前较为常用的建模方式是在卒中的基础上联合CUMS模拟动物PSD状态,但不同的实验室选用的卒中模型、CUMS刺激模式及行为学评价方案不尽相同。卒中模型各自存在其优缺点:MCAO模型较经典,能很好地模拟临床卒中,但大鼠血管细而软,死亡率高,对操作者的要求较高,且易损伤血管周围迷走神经[5]。BCCAO是另一种较常用的卒中模型,术后更易导致老鼠产生抑郁行为[23],但术后动物的感觉及运动损伤较重,可能对抑郁行为评价会产生一定影响。开颅电凝法及光栓塞法,导致的皮层损害较恒定,但开颅电凝法操作难度大,对动物脑部的损伤较大。一个好的动物模型,除需具备与人类疾病的相似性外,还必须具有可靠性、适用性、可控性、可重复性、易行性及经济性[27]。标准化的PSD模型要求操作简单、成功率高、死亡率低、稳定性好,易进行后期药物试验及机制研究。

6 PSD模型建立存在的问题及展望

目前各实验室建模仍存在诸多问题:(1)卒中模型建立后,其稳定性及有效性无统一的评价标准;(2)神经功能评定方法不一;(3)卒中模型建立后何时开始CUMS,每种CUMS模式刺激多长时间以及CUMS的组合形式均无明确定论;(4)PSD建模成功后何时开始行为学评价,哪一种或哪几种行为学评价方法更能体现建模的成功,尚不明确;(5)PSD模型的兴趣缺失症状是一过性的应激刺激还是持续性的变化,尚不明确[28];(6)尽管某些实验室尝试在方法学上进行改良,但改良模型的可靠性有待考量。为促进PSD发病机制及治疗的研究,建立一个稳定、标化的动物模型及行为学评价标准具有重要意义。