2018年毛细管电泳技术年度回顾

2019-05-29李林森汪慧敏韩诗邈赵新颖

色谱 2019年5期

李林森,赵毅,汪慧敏,韩诗邈,赵新颖,屈锋*

(1. 北京理工大学生命学院, “分子医学与生物诊疗”工业和信息化部重点实验室, 北京 100081;2. 北京理化分析测试中心, 有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室, 北京 100089)

1 期刊论文聚焦

截止至2018年12月31日,以“capillary electrophoresis”或“capillary isoelectric focusing”或“micellar electrokinetic chromatography”或“CE-MS”为关键词在ISI Web of Science数据库中进行主题检索(排除capillary electrochromatogaphy、microchip和capillary monolithic column),共检索到期刊论文354篇,较去年450篇减少约四分之一。本年度分析化学学科最具影响力的杂志Analytical Chemistry共发表CE相关的论文15篇,与去年28篇相比下降近50%;发表论文的研究范围覆盖蛋白质组学、蛋白质药物、手性拆分机理、疾病诊断、仪器改进以及环境监测。CE的专业期刊之一,Electrophoresis,发表CE相关论文57篇,文章数量略低于去年的72篇,但仍是发表CE论文最多的期刊。其他重要的分析化学期刊Journal of Chromatography A发表42篇,Talanta发表22篇,Journal of Separation Science发表30篇,Analytica Chimica Acta发表12篇,这些杂志发表的CE论文数与往年情况基本持平。本文根据发表期刊论文的质量和数量,分别从生命科学研究、药物分析、手性拆分、医学及临床检验、CE相关仪器改进、食品安全检验和环境监测7个方面进行介绍。

1.1 生命科学研究

近年来,CE在生命科学领域的应用研究越来越多,主要涉及蛋白质、核酸、糖等生物分子。值得注意的是,Analytical Chemistry本年度发表的15篇CE论文中有6篇与蛋白质组学研究相关。蛋白质组学研究包括:毛细管区带电泳-串联质谱法(CZE-MS/MS)结合尺寸排阻色谱法(SEC)和反相液相色谱法(RPLC),可鉴定来自大肠杆菌蛋白质组的5 700种蛋白质形式。CZE-电喷雾电离串联质谱法(CZE-ESI-MS/MS)结合反相超高效液相色谱法(UHPLC),可鉴定α-1-酸性糖蛋白中268个位点特异性N-糖肽。采用微尺度反相液相色谱(μRPLC)进行肽初步分离,并结合基于动态pH连接的CZE-MS/MS对乳腺癌MCF7细胞蛋白质组进行研究,结果表明,仅需5 μg MCF7蛋白质消化物即可鉴定出超过7 500种蛋白质以及近60 000种肽。CZE-ESI-MS/MS结合涂层毛细管、电动泵浦鞘流纳米电喷雾界面、轨道阱液相色谱-质谱仪和先进峰值测定算法,可从220 ng的人慢性髓系白血病k562细胞消化液中鉴定出约27 000个肽以及4 400个蛋白质组。采用毛细管区带电泳-紫外分光光度法(CZE-UV)和CZE-ESI/飞行时间质谱法(CZE-ESI/TOF-MS)监测热胁迫和pH胁迫下重组艾蒿过敏原中的脱酰胺作用和羊毛硫氨酸形成。构建强阳离子交换-反相液相色谱-毛细管区带电泳-串联质谱(SCX-RPLC-CZE-MS/MS)平台,可从老鼠大脑蛋白质组消化产物中鉴定出8 200个蛋白质组和6.5万个独特肽段。CE-串联纳米电喷雾电离高分辨率质谱(CE-nanoESI-HRMS)通过反相分馏增强对单个神经元的肽检测,可从500 pg蛋白质消化物中鉴定出141种蛋白质。采用磷酸钙共沉淀法改进蛋白质分馏技术用于CE中人乳蛋白的快速表征,并结合离线耦合液相色谱-串联质谱鉴定人乳中的微量蛋白质。

此外,CE还可用于研究蛋白质之间的相互作用。蛋白质交联毛细管电泳(PXCE)使用戊二醛作为交联剂,可对7种不同蛋白质相互作用的亲和力进行测定。应用亲和毛细管电泳法(ACE)研究两种血清白蛋白与类肝素的相互作用。

核酸研究包括:毛细管凝胶电泳法(CGE)结合基于聚乙烯吡咯烷酮和甘油设计的柔性、低黏性筛分介质,检测100～1 000 nt RNA的纯度和稳定性。应用平衡混合体系非平衡毛细管电泳法和高通量测序筛选含有G-四链体结构的适配体。使用寡核苷酸修饰的量子点与荧光标记的核酸样品杂交制备福斯特共振能量转移探针,并结合CE用于特定核酸序列的检测。高速毛细管筛选电泳-激光诱导荧光检测(HSCE-LIF)可用于3种内源性微RNA(miRNA)的分离测定。应用CE-LIF筛选盐酸克伦特罗的核酸适配体。

糖类和小分子研究包括:短扫集CE-LIF结合荧光成像检测探针FluoZin-3测定游离的以及与金属硫蛋白2a结合的Zn2+。开发新型的基于发光体和抗原共载金纳米颗粒的化学发光信号放大(CL)策略来提高CE-CL检测灵敏度,用于女性血清中痕量睾酮的检测。共价修饰反极性CZE-MS分析肝素/硫酸乙酰肝素寡糖混合物,可鉴定80多种聚糖分子组成。CE结合场增强样品进样-扫集-胶束溶剂堆积(FESI-Sweeping-MSS)检测复杂生物样品中痕量有机阴离子化合物。无鞘CE-ESI-MS通过一锅两步衍生化反应对哺乳动物细胞和人体组织中氨基酸和有机酸进行分析;CE-电容耦合非接触式电导(C4D)测定大黄素诱导HeLa细胞凋亡期间Na+和K+的浓度。CE-MS分析亚麻种子中13C标记的氨基酸。

1.2 药物分析

CE技术的不断改进使得其在药物分析领域的应用研究优势凸显,主要表现在蛋白质药物研究、药物作用机理和药物筛选,天然产物的成分分析以及合成药物的检测。

蛋白质药物研究包括:应用毛细管等电聚焦-质谱(cIEF-MS)分离与成像cIEF-UV曲线关联良好的单克隆抗体电荷变体,实现了单个单克隆抗体(mAb)电荷变体的在线TOF-MS检测和表征。使用基于十六烷基磺酸钠的毛细管电泳法(CE-SHS)表征和定量治疗性蛋白质,与传统的基于十二烷基硫酸钠毛细管电泳法(CE-SDS)相比,CE-SHS可使峰值分辨率和塔板数分别提高3倍和8倍。cIEF-MS对西妥昔单抗电荷异质性进行深入表征,可鉴定免疫球蛋白降解酶S裂解后的8个电荷变体和还原处理后的11个电荷变体。采用基于流通微通道接口的cIEF-MS分析肽、蛋白质和单克隆抗体,鉴定出具有0.1个pI单位差异和1个道尔顿分子量差异的变体。采用毛细管电泳-固定化酶反应器在线检测青霉素酶活性。应用低流量无鞘CE-MS分离异构纳米抗体的变体和片段,每个单克隆抗体可以识别多达32个可结晶段(Fc)变体。CZE-MS用于免疫球蛋白1型mAb及其Fc片段的分析。应用CE-ESI-MS在糖肽水平上对N-聚糖种类进行定量,用于表征和量化多种治疗性单克隆抗体糖基化异质性。

药物作用机理研究包括:通过等温滴定量热法、荧光光谱法和前沿分析毛细管电泳法(FACE)评估华法林与人或牛血清白蛋白分子之间的相互作用。ACE结合温控离子液体-双水相体系测定抗癌药物甲氨蝶呤和长春碱与人α1酸性糖蛋白的结合常数。CE-LIF用于富勒烯与抗癌药物DOX络合物在不同pH值下的释放度分析,研究证实富勒烯对pH敏感,能促进药物在溶酶体中的释放。基于CE开发在线纳米反应器用于抗血栓药物筛选的酶试验。CE基于对映选择性研究氯胺酮及其代谢物的II期代谢。

药物筛选研究包括:手性配体交换毛细管电泳法用于评估丙氨酸氨基转移酶(ALT)酶反应器的酶解效率,并应用于ALT抑制剂的筛选。CE结合层流剖面的横向扩散技术用于抗血栓药物筛选的酶试验。固定化细胞毛细管电泳法(ICCE)用于快速筛选靶向整合素巨噬细胞抗原-1的抗肿瘤转移药物。应用CE筛选断点簇区域Abelson酪氨酸激酶抑制剂。ACE筛选和鉴定潜在候选药物,用于分析针对强直性肌营养不良症1型相关的病理RNA探针。CE分离和测定两种形式的氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶,用于抗菌药物的研究。采用ACE和分子对接方法研究凝血酶与10种酚类化合物之间的相互作用,用于凝血酶抑制剂的筛选。

此外,CE还可用于药物理化性质的研究:毛细管等电聚焦-全柱成像法用于测定缩短的胰高血糖素样肽-1等电点。CE基于两值法和一值法研究卡西酮衍生物的酸度。胶束电动色谱法(MEKC)用于评估24种具有精神药物活性的7H-嘌呤-2,6-二酮衍生物的亲脂性。

天然产物成分分析研究包括:应用MEKC分离测定6种香豆素和6种呋喃香豆素,白花蛇舌草提取物中的环烯醚萜类、苯丙素类和类黄酮类化合物,白花前胡素A、B、C和柴胡中的4种柴胡皂苷。应用CZE鉴定连翘中异构五环三萜酸的3种微成分。CZE结合扫集-胶束溶剂堆积同时测定当归中3种有机酸。CE场放大样品堆积(FASS)结合基质固相分散萃取测定3种有机酸。CE场放大进样法(FASI)用于枸杞中6种黄酮类化合物的检测。CZE大体积样品堆积(LVSS)在线富集测定5种喜树碱生物碱。微芯片毛细管电泳结合激光诱导荧光检测(MCE-LIF)用于快速测定芦荟素A和B的含量。

合成药物检测包括:人尿样中的抗抑郁类药物、四环素类抗生素、头孢吡肟、卡马西平和氯巴扎、阿替洛尔和美托洛尔;人血浆中的酪氨酸激酶抑制剂、妥布霉素、盐酸喹那普利及其代谢物盐酸喹普利拉;血清中的苯二氮卓类药物、D-安非他明和苯海拉明;固定剂量复方片中异烟肼和利福平;金刚烷类药物、喹啉-2-硫酮、8-巯基喹啉盐酸盐、卡铂与替莫唑胺的二元混合物等。

CE还可用于药物的质量评估,包括:丹磺酰衍生物普瑞巴林的对映体纯度,替拉那韦胶囊的有机杂质,注射剂型中16种抗肿瘤药物有效成分的含量,药物制剂中阿莫地喹及3种合成杂质的含量,吲哚美辛中3种已知杂质的含量,右旋美托咪定的手性纯度。

此外,CE使用蛋白质作为探针,可用于研究纳米药物的表面覆盖度。CE-UV可用于分离和定量纳米药物载体中未包封的阿霉素。

1.3 手性拆分

手性拆分一直是CE的优势。CE在保持氨基酸、药物分子等对映体分离方面的优势外,在新型手性拆分剂的开发,以及手性拆分机理研究方面也有进展。

手性拆分机理研究包括:ACE力矩分析法用于手性分子间相互作用的动力学研究,分子间相互作用理论上会引起峰值方差的增加,通过分析β-环糊精(β-CD)与苯氧丙酸分子间相互作用来验证预测结果,与数值分析结果一致。基于CE构建一种数学模型,以羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为模型配体,通过计算表观电泳迁移率可得出最优配体浓度。以硫酸CD为手性拆分剂,研究毛细管电泳阳离子场放大进样。基于CE研究了11种中性CD和5种手性离子液体对同型半胱氨酸的对映体分离效果。使用CE研究了特布他林对映体对各种CD的亲和模式。应用CE研究不同CD与美托咪定对映体的络合作用。采用CE研究CD诱导的取代卡西酮的酸性修饰,研究表明,pKa位移有助于卡西酮的手性分离。

新型手性拆分剂研究包括:使用两种新型的羟基酸手性离子液体作为拆分剂,与单一CD体系相比,药物对映体的分离效果显著改善。首次合成一种氨基三唑-β-CD离子液体衍生物,用于CE中丹酰化氨基酸和萘普生的对映体分离。基于CE建立氨基酸手性离子液体与天然α-CD的协同对映体系统,比单一α-CD系统具有更强的对映选择性。使用硫酸软骨素D作为新型拆分剂,结合羧甲基-β-CD手性拆分6种基本外消旋药物。

手性药物拆分研究包括:以介孔有机硅材料(1,4-二(三乙氧基硅基)-苯配体)作为固相萃取吸附剂,使用硫酸-β-CD拆分水样中7种不同性质药物。以HP-α/β-CD和麦芽糖糊精作为两段手性柱段建立部分填充毛细管电泳法,对10种外消旋药物进行手性拆分。在CZE模式中,分别以2-羧乙基-CD、2-羟丙基-CD、硫酸化CD、HP-γ-CD、2-羟乙基-β-CD、酸性氨基酸与HP-α/β-CD等作为手性拆分剂,用于分离多种药物对映体。

手性氨基酸及其他小分子分析研究包括:使用β-CD拆分普萘洛尔对映体,绿茶中6种主要的儿茶素和茶氨酸对映体,4种5-亚硝基嘧啶衍生物的旋转异构体,8对9-芴甲氧羰酰基氯衍生的D、L型氨基酸。HP-β-CD结合手性离子液体分离测定去氢钩藤碱和去氢钩藤碱b。HP-β-CD结合三氧-甲基-β-CD拆分6种苯氧基酸除草剂的对映体。四丁基铵-L-精氨酸离子液体和β-CD联用手性拆分麻黄碱、伪麻黄碱和甲基麻黄碱异构体。部分填充毛细管电泳耦合两个不连续功能柱段以拆分色氨酸和酪氨酸的对映体。

1.4 医学及临床检验

医学及临床检验是CE应用研究的重要方向之一,主要是基于疾病相关标志物的疾病诊断和病理分析。检测的样品包括血浆、血清、尿样、脑脊液、红细胞等。

疾病诊断研究包括:在线SPE-CE-MS用于纯化、预浓缩、分离和表征癌症血清中的miRNA及其转录后修饰,miRNA标准品检出限是CE-MS的1/50,且在白血病患病组中仅检测到2种浓度极低的miRNAs。定量毛细管电泳法(qCE)结合多重聚合酶链式反应(mPCR)用于检测3种牙周病病原体,采用了改进时间修正内标法来快速精确定量mPCR产物。基于CE建立线粒体排列系统用于细胞内线粒体计数。MEKC结合固相微萃取测定尿液中5种神经递质。基于CE-MS开发通用的尿液多肽标记物模式,用于实体瘤的检测。CZE-基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测载脂蛋白-Ⅲ和其人工修饰品种,用于先天性糖基化障碍的诊断。CE-C4D用于监测癫痫患者血浆中托吡酯的含量。毛细管电泳发光二极管诱导荧光检测法监测人胚胎的氨基酸代谢率,用于辅助生殖。CE-C4D结合SPE测定肾炎患者尿液中草酸和柠檬酸代谢物。MEKC测定帕金森病患者红细胞中腐胺含量。CZE分析结构类似的转铁蛋白糖型,可用作先天性糖基化疾病的筛查。变性毛细管电泳(DCE)检测异柠檬酸脱氢酶1和2的基因突变,用于脑瘤患者的预后评估。

病理分析研究包括:γ-CD介导的CZE测定人血浆和脑脊液样品中D/L-兴奋性氨基酸的浓度,统计分析显示,血浆中L-天冬氨酸浓度与阿兹海默病严重程度之间呈中度负相关。采用CE-MS研究参与2型糖尿病的人胰岛淀粉样蛋白多肽寡聚化。CE结合蛋白质结晶学和分子动力学模拟研究精氨酸对胰岛素寡聚化的影响,综合结果表明,离子强度对胰岛素组装有很强影响。CZE检测人细胞中的5-氟胞嘧啶(5-FC)和5-氟尿嘧啶(5-FU),研究表明,在携带胞嘧啶脱氨酶与5-FC自杀基因的细胞中5-FC可成功转化为5-FU。FACE用于评估血小板和8种生物碱之间的相互作用,结果表明,海蓝碱、脱氢榛子碱和异钩藤碱与血小板之间有相对较高的亲和力。

1.5 CE相关仪器改进

进一步提高毛细管电泳仪的检测灵敏度和与现有技术联用一直是CE研究发展的重要方向。

相关检测器研究包括:便携式毛细管电泳仪搭配深紫外荧光检测器(FD)用于测定口服液中的非法药物,该检测器配备了5种可互换的发射滤光片,发射波长范围为278～600 nm,可用于多种天然荧光非法药物的测定。应用MEKC测定3种姜黄素类化合物,以445 nm激光二极管为激发源,构建了共聚焦激光诱导荧光检测器,可使3种化合物的荧光信号分别增强77、57和47倍。搭建光漂白进样-激光诱导荧光检测毛细管电泳(OGCE-LIF)系统拆分5对D/L-氨基酸对映体,用于D-氨基酸的检测以及D-氨基酸氧化酶活性的测定。

CE-MS接口及性能研究包括:开发了用于连接CE与多收集器电感耦合等离子体质谱(MC-ICP-MS)的接口,对核样品中的铀(U)和钚(Pu)同位素比值进行精确测量,分析物含量仅需nL级,获得的U、Pu同位素比值的重现性可与热电离质谱法相当。使用3D打印装置开发CE-MS接口来改进CE热控制问题。使用同轴鞘流接口和聚四氟乙烯端帽制造CE-ICP-MS接口,来检测抗癌药物顺铂制剂中195Pt。采用基于机械阀门接口的二维毛细管电泳-质谱(CE-CE-MS)来解决非挥发性物质对电喷雾电离过程的干扰问题。低鞘流ESI接口用于耦合CE-MS,可在神经细胞培养物中成功鉴定出神经传递相关物质。使用纳升阀将成像毛细管等电聚焦(icIEF)与质谱联用,可准确定量生物治疗药物中主要的异构体、酸性和碱性变体。

1.6 食品安全检验

CE在食品安全检验方面最明显的优势就是分离效率高,主要检测内容包括食品营养成分分析及有害成分检测。

营养成分包括:发酵乳制品中乳链菌肽;乳制品、葡萄酒中生物胺;婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白;液态奶样品中左旋肉碱和乙酰左旋肉碱;乳制品中L-羟脯氨酸;啤酒麦芽汁、葡萄酒中鞣花酸;酱油、食醋中氨基酸;柑橘类水果、茶叶、玫瑰果叶中黄酮类化合物。

有害成分包括:食品中食源性致病菌;牛奶样品中磺胺类药物、大环内酯类抗生素;保鲜果实中合成食品着色剂;花生中曲霉分生孢子;环境水、蜂蜜和番茄样品中7种三嗪类除草剂;蔬菜中敌百虫残留;膳食补充剂中8种合成药物;超热处理牛奶样品中硝酸盐和硫氰酸盐离子;牛肉中沙拉沙星和二氟沙星;海鲜中麻痹性贝类毒素、河蚌毒素和软骨藻酸;面包中丙酸盐和山梨酸盐。

CE-LIF对麦芽汁样品中的葡萄糖寡聚物进行分析,以监测两种不同类型酵母介导的糖发酵过程中低聚糖的组成变化。此外,可采用CE-MS鉴别咖啡掺假,结果表明,岩藻糖、木糖,葡萄糖可用作潜在标记物来识别样品掺假。使用离子交换色谱-动态涂布毛细管电泳法(IEC-DCCE)可检测贝类中2种主要过敏原(原肌凝蛋白和精氨酸激酶)。

1.7 环境监测

CE-UV结合FASI、瞬时等速电泳(tITP)以及逆流电动增压(CF-EKS)用于饮用水中砷形态分析,富集倍数高达230～1 200。CE结合荧光探针选择法检测超痕量铀酰离子,可成功用于放射性样品中铀酰离子的测定且无高辐射危险。CZE-tITP用于测定水中氟化物的含量。CE-C4D用于检测海水中8种生物胺。CE结合分散液-液微萃取测定水样中5种氯酚。CE-UV结合SPE检测水样中3种有机汞。CE-MS结合免疫亲和萃取用于测定环境水样中的8种典型氟喹诺酮类抗生素。MEKC测定地表水残留物中氟喹诺酮类化合物的含量。

2 国内外会议

2018年与CE相关的国际学术会议有5个,国内学术会议有3个(见表1)。值得关注的是2018年度举行了“京鲁色谱行业女学者应用技术交流会——毛细管电泳专场”,会议针对CE技术的应用进行了讨论和交流。这也是国内第一次就毛细管电泳应用技术展开的专场交流活动。

2018年度会议中CE联用技术报告居多,包括CE-MS、CE-HRMS、CE-ESI-MS、CE-ESI-HRMS、CE-MALDI-TOF-MS、CE-ICP-MS、CE-UV和CE-LIF等,此外,还有CE与C4D联用、CE与电化学发光传感器联用等。主要创新点总结如下，生命科学领域包括蛋白质、核酸、糖类及细胞代谢产物4个方面。蛋白质:CE开发双特异性融合蛋白、CE-SDS-LIF与CE-MS表征酶对医疗蛋白的降解作用。核酸:DNA/RNA生物标志物的分析、CZE研究单链DNA序列的分离机制等。糖类:CE-UV分析人类免疫缺陷病毒(HIV)的糖基化、糖类复合物结合常数的估算等。细胞代谢产物:CE-ESI-MS描述非洲爪蟾胚胎中单细胞的代谢图谱、单个胚胎细胞的蛋白质和代谢产物的原位分析等。

医药方面包括药物分析与开发和临床检测。药物分析与开发:CE检测小儿口服制剂中的L-瓜氨酸等。临床检测:CE-MS用于临床代谢组学和生物标志物的发现;CZE检测载脂蛋白C-III糖型及其相关物质用于先天性糖基化障碍的检查;CE-MS定量检测血浆中B型钠尿肽的含量以诊断与治疗心力衰竭等。

方法学包括CE分辨率的提高,毛细管表面特性的改变及CE分离度的提高,新型毛细管电色谱柱，环形毛细管电泳系统，毛细管电泳堆积技术，生物分子的测序和加工,微流控毛细管凝胶电泳的开发,新型毛细管电泳-酶微反应器，毛细管免疫传感器等。

表 1 CE相关的国内外会议

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其他还包括CE-ESI-MS的环境和农业应用,CE-ICP-MS在细胞胞浆条件下表征量子点转化,微生物的分离与分析,基于CE的单细胞质谱研究,非共价分子相互作用强度和特异性定量评价,CE-C4D检测有机和无机离子的双组分缓冲体系,低流量CE-MS和ACE测定复合物稳定常数等。

3 毛细管电泳技术标准

2015年度回顾中对CE技术标准做了简介。时隔3年,国内外基于CE技术的现行标准共计83条,与2015年相比,增加了45条,数量增加了近1倍。新增标准名录见表2。其中,在生物药方面的应用尤为突出。欧洲和美国各增加了8条标准,内容均为蛋白质药物分析;俄罗斯依旧在酒、饲料分析方面推出了标准。我国农业部推出了毛细管电泳检测饲料中有机酸的标准,另外4条则是药典中用于抗体药物的分析。此外,墨西哥、英国、日本、印度以及其他国家也陆续推出了基于毛细管电泳技术的标准。由此可见,毛细管电泳技术的应用越来越广泛,尤其是在生物药分析方面的优势不可替代。

表 2 新增的毛细管电泳法相关标准

表 2 (续)

4 国产毛细管电泳仪

2016年度回顾中对毛细管电泳仪品牌和型号做了简介。时隔2年,市面可查的国内毛细管电泳仪商家近40家,统计主要国产毛细管电泳仪厂家的信息见表3。国际品牌(Beckman, Agilent, Sebia)依旧为主流,其中Beckman(现Sciex公司)和Agilent公司在原有仪器型号基础上又推出了C100HT生物制品分析系统、Agilent 7100与ICP-MS和ICP-MS/MS系统。国产仪器公司大幅度增加,推动了国产毛细管电泳仪的研发和生产。值得关注的是,海能公司于2017年12月30日出资购买欧洲DL公司“高效毛细管电泳仪”相关专利实施许可权及非专利技术、软件所有权等全部技术产权,用以研发和生产国产高效毛细管电泳仪,进而布局生命科学、医疗诊断和生物制药等领域。