异常色谱峰来源排查——色谱仪研发测试过程中的经验分享

高华云,耿浩然,王丰琳,唐 涛,李 彤*

(1. 大连工业大学, 辽宁 大连 116034; 2. 大连依利特分析仪器有限公司, 辽宁 大连 116023)

高效液相色谱是分析化学领域中最常用的分析工具之一,强大的分离能力使其在化工医药、食品安全、环境监测、生命科学等领域有着非常广泛的应用。但是,相对较弱的定性能力,增加了对仪器研发及测试过程中异常现象的分析难度。

大连依利特分析仪器有限公司自2013年开始研发全新一代的iChrom 5100系列高效液相色谱系统,并于2015年开始投放市场。无论是在样机的研发测试还是在实际应用过程中,出现过多次色谱峰异常的现象,即经常出现一些可重复的“怪峰”(或称之为“鬼峰”)。如图1所示,按照流路顺序方向排查流动相、样品、仪器硬件的问题,找到了部分异常峰的来源,但仍有个别异常峰没能找到产生原因。如前述,色谱仪自身的定性能力不足,即便是配合使用二极管阵列检测器(DAD)获取异常峰的紫外-可见光谱图,仍然难以确定其具体组成及来源。分析并消除重复出现的异常峰,是仪器研发及应用过程中必须解决的问题。

针对上述问题,我们经过长期的实验,对不同型号、规格的仪器进行对比,通过科学分析找到了异常峰的一种有代表性的来源,在此分享给分析工作者。

1 异常色谱峰的发现

1.1 多肽类样品的分析

图2是某种需要进行大规模制备的多肽样品谱图,可以看出,异常峰出现在全部样品色谱峰之后(35 min左右)。理论上样品峰之后的异常峰不影响实际样品的分离以及制备实验的要求,但是为了药物研究,有必要知道异常峰的来源以及组成。按照流路顺序方向排查,经过多次不同的实验证实,图中所示异常并不是样品没有完全流出或前一次实验遗留在色谱柱中的残留多肽样品。

1.2 氯代多环芳烃类样品的分析

图3是氯代多环芳烃类样品及以流动相作为空白样品的谱图,可以看出存在一组可重复的异常色谱峰(13.5～40.0 min)。氯代多环芳烃是多环芳烃氯化得到的产物,原料和产物结构相对简单且稳定,理论上不会出现其他杂质。通过标准品比对,目标物氯代多环芳烃峰的保留时间为15.5 min,因此在13.5～18.0 min出现的异常峰会影响目标检测物氯代多环芳烃峰的定量分析。按照流路顺序方向排查,经多次不同条件测试证实,所出现的异常峰现象与样品进样与否、色谱柱温度、仪器硬件等色谱实验条件无关。

图 5 氯代多环芳烃类样品的谱图分析条件同图3.

2 异常色谱峰的解析与验证

为解析异常色谱峰的来源,针对上述实验结果,按照流路顺序方向对流动相、样品、仪器硬件均进行了替换试验,同时还考察了不同填料、不同尺寸色谱柱、乙腈-水流动相组成比例、温度和储存时间等,均没有准确找出异常峰的来源。之后对系统流路之外的前处理过程进行考察,更换了不同材质的样品过滤膜和流动相溶剂过滤膜,最终发现了异常峰的来源——溶剂过滤膜。

在实验过程中,过滤乙腈所使用的滤膜均为有机滤膜,包括尼龙66、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯3种。但滤膜的化学相容性表显示,3种滤膜对乙腈的耐受程度不同,其中尼龙66的耐受能力最差。进一步的实验结果还表明,不同材质的滤膜过滤乙腈后所产生的异常色谱峰存在着显著的差异,实验结果参见图4。材质为尼龙66的滤膜所产生的异常峰响应最大,约为2.5 V; 聚偏氟乙烯滤膜产生的峰高略低; 相对而言,聚四氟乙烯滤膜的测试结果是3种材质中最好的,但是异常峰最少的是不经过滤的乙腈。

在找到异常峰的来源后,对氯代多环芳烃类样品进行了重新分析,结果如图5所示,异常峰不再出现。

图 4 不同滤膜过滤乙腈后基线空白图(a. 原始图; b. 局部放大图)色谱条件同多肽类样品分析(图2). 1. 不过膜; 2. 聚四氟乙烯膜; 3. 聚偏氟乙烯膜; 4. 尼龙66.

3 结语

从本验证实验结果可以看出,滤膜是文中所述实验异常色谱峰产生的主要因素,由于不同材质的滤膜对有机相的耐受能力不同,所产生的异常峰峰高之间也存在着显著的差异。所以,建议在做色谱实验时,若出现异常色谱峰时,不仅要考虑流路系统上涉及的流动相、样品及仪器硬件可能带来的影响,也同样不能忽略像溶剂过滤膜这类前处理耗材带来的影响。