miR-578表达上调对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及其与PREX2a的相关性分析

张 祥，王垒垒，姚俊朝，赵永辉，李贺扬，刘旭光，龙银波，刘 晨，王 鹏

(河北省沧州市中心医院神经外科 061000)

微RNA(microRNA，miRNA)是一种长17～25个核苷酸的单链内源性的非编码RNA,其可通过与靶基因的3′UTR区互补配对，指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制；也可以通过类似siRNA的RNA干扰途径，对基因表达进行抑制性调控[1-2]。它们在许多正常生物学行为如细胞生长、增殖及凋亡等过程中发挥重要作用[3]。研究发现，miR-578在BRCA1/2相关乳腺癌中表达下调且可影响血管内皮生长因子、黏着斑激酶及缺氧诱导因子等信号通路[4]。PREX2a作为一种肿瘤相关蛋白，通过抑制同源性磷酸酶-张力蛋白活性在包括脑胶质瘤等多种恶性肿瘤的发生、发展中发挥生物学活性[5]。胶质瘤作为颅内最常见恶性肿瘤以无限增殖及向周围正常脑组织浸润而著称，而miR-578在其发生、发展中所发挥的作用仍未有报道，本研究旨在探讨miR-578对脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及潜在机制。

1 材料与方法

1.1材料 人脑胶质瘤组织及正常脑组织分别取自沧州市中心医院神经外科脑胶质瘤及癫痫手术治疗患者，其中正常脑组织8例，不同级别的脑胶质瘤组织56例，其中Ⅱ级18例、Ⅲ级15例、Ⅳ级23例。人胶质瘤U87、U251细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库，由沧州市中心医院神经病学研究所冻存。miR-578类似物序列(5′-AAT GCT ATT ATA AAC CCA TT-3′)及阴性对照序列(5′-ACT ACC GTT GTT ATA GGT G-3′)由广州瑞博生物公司合成。Trizol试剂购自美国英杰公司，用于实施qPCR的miR-578定量试剂盒购自上海吉玛公司，GAPDH单抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，小牛血清和DMEM培养液购自美国Gibco公司，脂质体Lipofetmiane2000购自美国Invitrogen公司，膜联蛋白v-fitc凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，PREX2a(miR-578的直接作用底物)抗体购自美国Abzoom公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 胶质瘤细胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液置于37 ℃ 5% CO2相对湿度条件下的培养箱中培养，转染时将2×105个U87、U251接种在6孔板内，待50%～80%细胞融合后，经Lipofectamine2000介导将miR-578类似物和阴性序列分别转染到上述胶质瘤细胞中。转染后6 h更换完全培养液继续培养48 h，收集细胞用于实验研究。

1.2.2qPCR 采用Trizol法提取脑胶质瘤组织与正常对照脑组织标本中总RNA，转染后48 h的miR-578类似物和阴性序列组U87、U251细胞总RNA。分别用miR-578和U6引物于荧光定量PCR仪(美国，7500型ABI)进行Real-time PCR扩增，以U6作内参。选用20 μL扩增体系，反应条件：95 ℃ 3 min循环1次；95 ℃ 12 s，62 ℃ 60 s，循环40次，每2秒升高0.2 ℃，循环1次。按相对表达倍数=2-(△Ct目的RNA-△Ct内参RNA)计算各组织及细胞中miR-578和内参U6的相对表达量。

1.2.3Western blot U87、U251细胞转染后继续培养48 h，提取总蛋白。取150 g上样量，100 g/L十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质，电转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)。0.05 g/mL脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人PREX2a一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，加入小鼠抗兔IgG二抗(1∶1 000)孵育1 h。结果采用凝胶成像分析系统扫描。

1.2.4噻唑蓝(MTT)法 每组细胞按2×103个细胞(每孔200 mL)接种到96孔板，分别于接种后24、48、72 h每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL)，37 ℃条件下继续培养4 h，弃上清液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)200 mL，振荡15 min，紫外分光光度计570 nm波长测各孔吸光度值，每组设6个复孔。

1.2.5细胞平板克隆形成实验 转染后48 h，制备单细胞悬液，计数，取2×103个细胞接种于60 mm的培养皿中。培养2周后，弃去培养液，PBS轻洗2次，甲醇固定15 min，0.5%的结晶紫染色，显微镜下观察，计数细胞克隆。克隆形成率=(克隆形成数/接种细胞数)×100%。

1.2.6流式细胞术 转染后48 h用胰酶消化成单细胞悬液，收集至1.5 mL EP管中，PBS(0.01 mol/L，pH7.2)洗涤细胞2次，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min,收集细胞，75%乙醇1 mL、4 ℃固定18 h以上。200 μL RNAase(1 mg/mL)、37 ℃孵育30 min，800 μL碘化丙啶(PI)染色液混匀后4 ℃避光染色30 min，应用FACS Calibur(美国BD公司)流式细胞仪在488 nm检测。

2 结 果

2.1不同组织中miR-578表达情况 qPCR结果显示，WHOⅣ级胶质瘤组织中miR-578表达水平为(18.20±2.53)%，WHOⅢ级胶质瘤组织中miR-578表达水平为(36.20±3.34)%，WHOⅡ级胶质瘤组织中miR-578表达水平为(51.40±4.30)%；正常脑组织中miR-578表达水平为(59.60±4.31)%。miR-578表达与胶质瘤级别呈负相关(r=0.912，P=0.00)；胶质瘤组织中miR-578水平较正常脑组织明显降低(P<0.01)，见图1。

图1 qPCR胶质瘤和正常脑组织中miR-578表达情况

2.2胶质瘤细胞中miR-578、PREX2a表达情况 各细胞组的qPCR检测到miR-578类似物组miR-578水平较转入阴性序列组明显升高(P<0.05)，见图2；Western Blot检测到各细胞组的miR-578类似物组miR-578的直接作用底物PREX2a表达较阴性序列组明显下降(P<0.05)，见图2、3。

图2 胶质瘤细胞miR-578相对表达情况

图3 胶质瘤细胞PREX2a表达情况

图4 U87胶质瘤细胞生存能力情况

图5 U251胶质瘤细胞生存能力情况

A:U87细胞阴性序列组；B：U87细胞miR-578类似物组;C:U251细胞阴性序列组；D:U251细胞miR-578类似物组

图6 胶质瘤细胞细胞克隆形成率情况

图7 胶质瘤细胞凋亡情况

2.2转入miR-578类似物后对胶质瘤细胞增殖能力的影响 与转入阴性序列组比，U87细胞系的miR-578类似物组胶质瘤细胞在24、48、72 h的增殖率分别为(81.65±4.03)%、(68.38±3.67)%、(53.67±3.28)%，U251胶质瘤细胞在3个时间点的增殖率则分别为(79.67±3.06)%、(61.87±4.66)%、(45.39±2.84)%，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4、5。

2.3细胞平板克隆形成实验 与阴性序列组比较，转入miR-578类似物组U87细胞克隆形成率为(37.67±2.89)%、U251细胞为(34.67±3.26)%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

2.4流式细胞技术检测情况 与阴性序列组比较，U87、U251胶质瘤细胞的miR-578类似物组凋亡率明显增加(P<0.05)，见图7。

3 讨 论

恶性胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，属人类预后极差的肿瘤之一[6-7]。随着多模态三维影像融合与神经导航、神经电生理监测与唤醒手术、术中实时成像等技术在临床中逐步应用；替莫唑胺(temozolomide,TMZ)联合常规分割适形外照射的同步放化疗及TMZ序贯化疗成为恶性脑胶质瘤的标准治疗方案；恶性脑胶质瘤局部治疗的手段逐渐丰富，包括卡莫司汀缓释膜片及对流增强的局部化疗，推高了恶性脑胶质瘤的局部化疗药物浓度，使得脑胶质瘤治疗方法逐步增多，但其中位生存期仍不足18个月[8-10]。因此如何控制脑胶质瘤细胞增殖及迁移成为其治疗的重要研究方向。

miRNA作为与正常及病理情况下细胞增殖、运动等生物学特性密切相关的内源性非编码RNA成为近年研究的重点[11]。研究发现，众多miRNA在胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤细胞表型转化中发挥重要作用，如miR-451在胶质瘤细胞增殖-迁移表型转换中发挥重要作用；miR29C、miR134等与胶质瘤细胞增殖密切相关。研究表明，PREX2a作为一种鸟氨酸交换因子(GEF)，其通过促进肿瘤血管生成促进多种恶性肿瘤的转移且在胶质瘤表型转换中发挥重要作用，提示可能参与恶性肿瘤的发生和发展[12-13]。

本研究Western Blot结果显示，miR-578在正常脑组织中较脑胶质瘤组织中表达明显升高,且与脑胶质瘤级别呈负相关。qPCR检测结果显示：胶质瘤细胞中miR-578水平明显较正常脑组织降低，表明其在胶质瘤细胞中表达降低。转入miR-578类似物后胶质瘤细胞中miR-578水平明显升高，PREX2a明显下降。miR-578过表达的胶质瘤细胞增殖活性明显下降，表明miR-578在胶质瘤细胞增殖中起到负性调控作用。流式细胞技术检测胶质瘤细胞凋亡结果显示转入外源性miR-578类似物后，胶质瘤细胞更容易凋亡，表明miRNA-578表达低的胶质瘤细胞生存能力更强。

内含子中编码的miRNA作为一种细胞内生因子，对细胞生物学过程的调节比转录调节效果更快并且是可逆的[14]。以上研究结果表明，胶质瘤细胞中下调的miR-578可促进细胞增殖及增强胶质瘤细胞的生存能力，其机制可能与调节PREX2a相关。提示miR-578可作为对胶质瘤复发、转移及预后的预测指标，同时也为人脑胶质瘤治疗提供了新的思路。