藏红花素对糖尿病所致睾丸组织损伤保护作用的研究*

王立哲，王振贤，马晓伟

（1．邯郸市中心医院东区康复医学科，邯郸 056001；2．邯郸市中心医院内分泌一科，邯郸 056001；3．邯郸市中心医院神经内一科，邯郸 056001）

长期高血糖将诱发多组织器官并发症，包括睾丸组织，其发病率较非糖尿病患者高10倍以上，严重影响患者生命健康和质量[1]。藏红花素（Crocin）是在番红花中发现的一种水溶性化合物，具有良好的抗氧化作用和抗炎作用[2-3]，既往研究发现藏红花素具有改善糖尿病大鼠胸主动脉环舒缩功能、抑制视网膜微血管内皮损伤的作用[4-5]，并且王素莲等[6]研究发现藏红花素具有降低血脂的药理学作用。本实验采用链脲佐菌素（STZ）连续3 d腹腔注射30 mg/（kg·d）的方法制备实验性2型糖尿病大鼠模型，研究藏红花素对2型糖尿病大鼠睾丸组织并发症的抑制作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠100只（7周龄、体质量210～250 g），购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。饲养环境：恒温恒湿（23～25℃、相对湿度 65%～70%），光照周期12 h：12 h。适应性饲养1周后进行实验。

1.2 药物、试剂 藏红花素（美国Sigma公司，纯度≥99．9%，批号：E170411b）；睾酮试剂盒、糖化血红蛋白（GHb）测试盒（南京建成生物工程研究所）；胰岛素测定试剂盒（美国密理博公司）；TUNEL试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组、模型制备与给药 100只SD大鼠按照体质量随机分为正常对照组，模型对照组，藏红花素25 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）组，各组均20只。采用STZ连续3 d腹腔注射30 mg/（kg·d）的方法制备实验性2型糖尿病大鼠模型，以空腹血糖水平持续高于16．7 mmol/L认定为造模成功。称取适量藏红花素，生理盐水溶解并分别配置浓度为50、25、12．5 mg/mL 的藏红花素溶液，1 次/日，正常对照组和模型组均同步给予等剂量的0．9%氯化钠溶液（2 mL/kg），疗程12周。

1.3.2 空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、糖化血红蛋白（GHb）的测定 治疗完成后，通过尾静脉空腹采血，通过血糖仪测定FBG，并按试剂盒测定FINS水平和GHb水平。

1.3.3 称量体质量并计算睾丸指数 治疗完成后分别称取体质量并记录；腹腔注射水合氯醛实施麻醉，取睾丸组织并冲洗干净后，称量右侧睾丸质量，睾丸指数（%）=（睾丸质量/体质量）×100%。

1.3.4 睾酮含量测定 各组大鼠取睾丸组织前，开腹并经腹主动脉取血，1 500 r/min离心10 min取血清，通过生化分析仪测定各组大鼠血清中睾酮含量。

1.3.5 睾丸组织病变及细胞凋亡的观察 取称质量后的右侧睾丸组织，置10%甲醛溶液中进行固定，然后依次行石蜡包埋、切片、展片，然后通过常规HE染色进行睾丸组织病理学检查；取石蜡切片，根据试剂盒说明进行TUNEL染色，通过倒置光学显微镜下观察胰岛细胞凋亡（细胞核黄染为阳性着色）；计算凋亡指数（AI）：AI=（凋亡细胞数/胰岛总细胞数）×100%，每张切片分别取5个视野，分别进行计数和计算，然后取平均值。

1.3.6 透射电镜观察睾丸组织超微细胞结构 取左侧睾丸组织、快速修剪成约1 mm3小块，置于预冷（4℃）戊二醛溶液（浓度 2．5%）中固定 1 h后，进行磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗、丙酮梯度脱水进行逐步处理，然后依次进行Epon812包埋、超薄切片和铅铀双重染色，通过H-7650型透射电镜观察。

1.4 统计学方法 运用软件SPSS19．0进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FBG、FINS及GHb 水平测定结果 糖尿病模型对照组大鼠FBG水平、GHb水平较正常对照组大鼠均显著升高（P＜0．01），FINS 水平显著降低（P＜0．01）。与模型对照组比较经藏红花素50～100mg（/kg·d）治疗12周能够显著降低糖尿病大鼠FBG水平并提高FINS水平（P＜0．01或P＜0．05），并且藏红花素100mg（/kg·d）组 GHb 水平显著降低（P＜0．05）。见表 1。

2.2 体质量、睾丸指数及睾酮含量测定结果 糖尿病模型对照组大鼠体质量、睾丸指数和血清睾酮含量显著降低（P＜0．01）；经藏红花素50～100 mg（/kg·d）治疗12周能够显著提高糖尿病大鼠体质量、睾丸指数和血清睾酮含量，与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0．01 或 P＜0．05）。见表 2。

表1 各组大鼠FBG、FINS及GHb水平（s）Tab.1 Levelsof FBG，FINSand GHb of the rats in each group（±s）

表1 各组大鼠FBG、FINS及GHb水平（s）Tab.1 Levelsof FBG，FINSand GHb of the rats in each group（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0．01；与模型对照组比较，#P＜0．05，##P＜0．01。

GHb（μg/mL）正常对照组 20 6．09±0．91 13．17±1．98 33．16±1．54模型对照组 20 17．24±2．60* 7．42±1．36*45．82±4．63*藏红花素25mg/（kg·d）组20 15．93±2．87 8．56±1．48 44．75±4．79藏红花素50mg/（kg·d）组20 11．75±2．68#9．23±1．70#38．06±4．25藏红花素100 mg/（kg·d）组20 9．52±2．61##10．54±1．49##36．72±3．68#组别 动物数 FBG（mmol/L）FINS（mU/mL）

表2 各组大鼠体质量、睾丸指数及血清睾酮含量（±s）Tab.2 Body weight，testistissue index and the contentsof serum testosterone content of the ratsin each group（±s）

表2 各组大鼠体质量、睾丸指数及血清睾酮含量（±s）Tab.2 Body weight，testistissue index and the contentsof serum testosterone content of the ratsin each group（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0．01；与模型对照组比较，#P＜0．05，##P＜0．01。

睾酮（nmol/L）正常对照组 20 370．95±24．73 0．45±0．08 22．79±1．63模型对照组 20 168．14±17．68*0．28±0．07*16．16±1．58*藏红花素25 mg/（kg·d）组20 184．26±19．03 0．30±0．08 17．28±2．09藏红花素50 mg/（kg·d）组20 215．11±21．64#0．38±0．10##20．01±1．84#藏红花素100 mg/（kg·d）组20 238．49±22．75##0．42±0．12##21．67±1．99##组别 动物数 体质量（g） 睾丸指数（%）

2.3 睾丸组织病理学检查结果 与正常对照组比较，糖尿病模型对照组大鼠睾丸组织呈现明显的病理异常，主要表现为曲细精管萎缩、生精细胞脱落、生精细胞数量减少、精子数量严重减少等；与模型对照组比较经藏红花素治疗12周能够不同程度改善糖尿病大鼠睾丸组织病变，组间比较，以藏红花素100 mg/（kg·d）组效果最为显著，见图1。

图1 各组大鼠睾丸组织病理学检查结果（HE，×400）Fig.1 Testicular histopathological examination resultsof rats in each group（HE，×400）

2.4 各组大鼠睾丸组织细胞超微结构 正常对照组：胞核形态正常，染色质分布均匀，细胞器丰富；模型对照组：胞核固缩、染色质呈块状聚集、细胞器数量减少；藏红花素25 mg/（kg·d）组：染色质块状边集现象好转，细胞器略增多，间质血管内壁较光滑；藏红花素50 mg/（kg·d）组：胞核呈类圆形，染色质分别较均匀，细胞器数量明显增多；藏红花素100 mg/（kg·d）组：胞核呈椭圆形或梭型，染色质分布均匀且无边集现象，细胞器显著增多。见图2。

图2 各组大鼠睾丸组织细胞超微结构（透射电镜，×3 000）Fig.2 The ultrastructure of testicular tissue cells in each group（transmission electron microscope，×3 000）

2.5 细胞凋亡状况观察结果 与正常对照组比较，糖尿病模型对照组大鼠睾丸组织凋亡细胞数量明显增多；经藏红花素治疗12周能够不同程度减少糖尿病大鼠睾丸组织凋亡细胞数量。计算各组大鼠睾丸组织细胞 AI：正常对照组 AI为（2．61±0．79）%，模型对照组AI为（46．13±6．08）%，藏红花素25mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）组AI分别为（39．35±6．37）%、（28．97±5．16）%、（25．00±4．72）%；模型对照组 AI较正常对照组显著升高（P＜0．01），而与模型对照组比较，经藏红花素50～100 mg/（kg·d）治疗12周能够显著降低糖尿病大鼠睾丸组织细胞AI（P＜0．01或 P＜0．05）。见图 3。

3 讨论

睾丸组织并发症是糖尿病患者常见的并发症，尤其是长期血糖控制不佳的多年糖尿病患者，严重影响患者生活质量。因此，糖尿病患者应注意睾丸组织并发症的发生与防治。既往研究发现高血糖引发的睾丸组织结构、细胞病变以及继发性细胞凋亡是糖尿病所致睾丸组织并发症的重要病理机制[7-9]。

本实验参照李徽徽等[10]和阚敏宸[11]的研究方法，采用连续腹腔注射STZ的方法制备实验性2型糖尿病大鼠模型，研究藏红花素对糖尿病所致睾丸组织损伤的保护作用。藏红花素是从番红花中提取的一种具有多种生物学活性的单体化合物，既往研究发现藏红花素具有改善糖尿病大鼠胸主动脉环舒缩功能、抑制视网膜微血管内皮损伤、降低血脂的药理学[4-6]。但藏红花素对糖尿病所致睾丸组织损伤是否具有保护作用尚未见文献报道。本研究通过制备2型糖尿病大鼠模型并给予藏红花素进行治疗，研究发现藏红花素能够改善糖尿病大鼠睾丸组织曲细精管萎缩、生精细胞脱落、生精细胞数量减少、精子数量严重减少等病变，改善睾丸组织细胞细胞体积缩小、细胞核固缩、染色质块状浓集、线粒体等细胞器减少、内质网扩张等超微结构病变，抑制睾丸组织细胞凋亡，本研究结果与毛孙忠等[12]的研究报道基本一致。提示藏红花素对糖尿病所致睾丸组织并发症损伤具有一定的保护作用。

图3 各组大鼠睾丸组织细胞凋亡状况（TUNEL，×400）Fig.3 Theapoptosisof testicular tissueof theratsin each group（TUNEL，×400）

睾酮又称睾丸素，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，是机体重要的雄性激素，对精子生成具有重要的促进作用。血糖持续偏高是导致睾丸萎缩、睾丸功能降低的重要病理机制，睾丸指数也是反映睾丸状态的重量指标。本实验结果显示：经藏红花素治疗12周能够有效提高糖尿病大鼠睾丸指数和睾酮水平，提示藏红花素具有改善糖尿病大鼠睾丸功能的作用。

综上所述，藏红花素能够有效抑制糖尿病大鼠睾丸组织损伤，其机制可能与其提高胰岛素水平、降低血糖作用有关。