肠源性毒素硫酸吲哚酚与慢性肾功能不全大鼠心肌NLRP3炎性小体、miR-34a表达的相关性研究

靳文，鄢文，李冬义，陈洁琼，赵雅红

慢性肾功能不全(chronic renal insufficiency，CRI)是指各种慢性肾脏病的严重和/或终末阶段，以肾功能不可逆地丧失、水、电解质和酸碱平衡紊乱、体内代谢产物和毒素潴留、内分泌功能失调、合并多器官功能损害为主要临床特征的综合征，是我国居民疾病构成和死亡原因的重要组成部分[1-2]。心血管疾病是CRI的最常见并发症和不良预后的重要影响因素[3-4]。尿毒素硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)主要由肠道微生物来源的色氨酸酶介导色氨酸生成吲哚，最终在肝脏内代谢生成[5]。已有临床研究证实IS是CRI并发心血管不良事件的独立预测因子[6]。基础研究表明IS通过触发心肌组织炎症、心肌纤维化、心肌细胞肥大和凋亡等作用促进心力衰竭的发生发展[7-10]。本研究通过构建5/6肾大部分切除术构建CRI大鼠模型，旨在探讨NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(Nod-like receptor family pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎性小体在CRI大鼠心肌组织中的表达和潜在作用。

1 研究对象与方法

1.1 实验动物与分组

本实验选择220～250 g SD大鼠[购买自南方医科大学实验动物中心，实验动物许可证号为：SCXK (粵)2016-0041]为研究对象。将大鼠随机分为假手术组、CRI组。CRI组予以行5/6肾大部分切除术。以上每组20只大鼠。本实验研究严格遵守实验动物伦理规章，并在经广东省第二人民医院伦理委员会批准后开展研究。

1.2 5/6肾大部分切除术建立CRI大鼠模型

SD大鼠行5/6肾大部分切除术建立CRI大鼠模型，简要操作步骤如下：予以3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠进入麻醉状态后，予以仰卧位固定四肢，行气管插管并予以小动物呼吸机辅助呼吸。沿大鼠腹中线作切口，依次剪开皮肤、筋膜、肌肉、腹膜，撕开左肾包膜，暴露左肾动脉及其分支血管，结扎两支前侧分支血管中的一支及背侧分支血管，以观察到肾脏明显变白为准。术后逐层缝合组织。予以碘伏消毒皮肤切口。2周后以相同手术操作方式行右肾全切除，4周后成模。观察手术切口有无感染。若存在感染，可予以腹腔注射青霉素15万单位，连续应用3天。造模后8周用于实验研究。

1.3 大鼠肾功能和IS的检测

分别采用苦味酸速率比色法检测血浆肌酐(SCr)、脲酶波氏比色法检测血尿素氮(BUN)的表达。具体操作参考试剂盒说明书。采用高效液相-串联质谱法检测血清IS的浓度。

1.4 心脏超声检测大鼠心脏功能

各组大鼠均行心脏超声检测以观察心脏结构和功能。大鼠胸前备皮、3%戊巴比妥钠麻醉固定，使用IE33彩色超声检测仪L15-7io模式(深度2.0 cm，速度60 mm/S)，经左室长轴获2D，改M型模式，M线平行二尖瓣后基底部，以M型超声测量和计算以下左心室指标：左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室质量指数(left ventricular mass index，LVMI)、舒张早期的二尖瓣血流速度/二尖瓣环运动速度(E/e′)。每只大鼠在每个切面上检测2次，每次连续读取5个心动周期，取平均值。

1.5 Masson染色检测心肌纤维化

常规操作脱蜡；把切片置于Masson染色液泡制4 min；浸泡冰醋酸溶液 1 min；置于磷钨酸染5 min；0.2%冰醋酸洗涤2 min；以亮绿或苯胶蓝液复染5 min；再把切片置于0.2%冰醋酸浸洗三次；即予中性树胶把切片面封闭。显微镜下采取病理图像。采用Image Pro Plus 6.0定量分析心肌纤维化比例=纤维化面积/心肌总面积。每个样本随机选取5个视野进行分析。

1.6 蛋白印迹(Western blotting，WB)技术检测左室心尖部心肌组织NLRP3、IL-1β的表达

WB技术检测大鼠左心室心尖部心肌组织NLRP3、IL-1β的表达。以上目的蛋白抗体均购买自Abcam公司。简要步骤如下：提取并检测心肌组织蛋白浓度，取100 μg组织蛋白上样，电泳，转膜，用封闭液配制目的蛋白一抗(NLRP3、IL-1β)工作液，4 ℃下与膜孵育过夜后取膜于室温下以1×TBST缓冲液清洗4次，每次5 min。接着以含有二抗的封闭液与膜孵育1 h，室温下以1×TBST缓冲液清洗4次，每次5 min。最后加入化学发光底物，显影，拍照。使用ImageJ软件进行检测条带灰度值与GAPDH的比值(磷酸化蛋白以磷酸化蛋白灰度值与相应总蛋白灰度值比较)表示各组相应蛋白的表达强度。目的蛋白的相对表达水平=目的蛋白的灰度值/内参蛋白的灰度值。上述实验重复3次。

1.7 荧光定量PCR检测心肌组织miR-34a的表达

TRIzol法提取各组心肌组织总RNA，参考反转录试剂盒(Applied Biosystems公司，美国)说明书制备cDNA。miR-34a和U6内参的上、下游引物均由广州复能基因公司合成。miR-34a的引物序列：上游：5′-GCCTGGCAGTGTCTTAGCT-3′，下游：5′-GTGCAG-GGTCCGAGGTC-3′；U6的引物序列：上游：5′-CTCG-CTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。对心肌组织miR-34a进行实时定量RT-PCR检测。反应条件如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40循环。以内参U6对miR-34a进行归一化处理。目的基因相对表达量=2-ΔΔCt。

1.8 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验数据以均数±标准差表示，两组间样本的比较采用独立样本T检验。P<0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRI大鼠心功能减退、IS浓度增加

检验结果显示：与假手术组相比，CRI组大鼠血肌酐以及IS浓度增加(P<0.05)。心脏超声检查结果显示：与假手术组大鼠相比，CRI大鼠的LVEF减退(P<0.05)，LVMI和E/e′升高(P<0.05)，见表1。

表1 大鼠心肾功能以及IS水平

2.2 CRI大鼠的心肌间质纤维化比例和心肌细胞横截面积增加

Masson染色结果显示：与假手术组相比，CRI组大鼠左室心肌间质纤维化比例、心肌细胞横截面积均表达增加(P<0.05)，见表2。

表2 大鼠左室心肌间质纤维化比例和心肌细胞横截面积

2.3 CRI大鼠左室心尖部心肌组织miR-34a、NLRP3以及IL-1β表达增强

定量PCR检测结果显示：与假手术组相比，CRI大鼠左室心尖部心肌组织miR-34a的表达增强(P<0.05)；WB检测结果显示：与假手术组相比，CRI组大鼠左室心尖部心肌组织NLRP3以及IL-1β的表达增强(P<0.05)，见图1、表3。

图1 WB检测左室心肌组织NLRP3和IL-1β的表达

组别nNLRP3IL-1βmiR-34a(2-ΔΔCT)假手术组201.02±0.101.01±0.051.00±0.04CRI组201.71±0.102.16±0.151.82±0.09t值--21.481-32.903-37.508P值-<0.001<0.001<0.001

2.4 血浆IS与心功能、miR-34a、心肌间质纤维化比例和心肌细胞截面积、心尖部心肌组织NLRP3、IL-1β相对表达量的相关性分析

相关性分析结果显示：血浆IS与LVEF呈负相关(P=0.007)，与LVMI、E/e′、心肌间质纤维化比例、心肌细胞横截面积、心尖部心肌组织NLRP3、IL-1β、miR-34a等呈正相关(P<0.001)；提示IS可能是CRI介导心功能损伤的重要介质,见表4。

表4 血浆IS与心功能、miR-34a、心肌间质纤维化比例和心肌细胞截面积、心肌组织NLRP3、IL-1β相对表达量的相关性分析

3 讨论

本研究发现CRI大鼠血浆IS表达升高，LVEF降低、LVMI和E/e′升高，心肌间质纤维化比例和心肌细胞横截面积升高，组织中NLRP3、IL-1β以及miR-34a表达升高，提示IS可能是CRI引起心功能损伤的重要媒介。

人体肠道菌群主要由益生菌、中性菌以及病原菌等数千种细菌组成，通过产生大量具有生物活性的代谢物质对机体的生理和病理生理功能产生影响。如益生菌能够利用饮食中纤维、蛋白分解代谢产生维生素和氨基酸，有助于营养物质吸收，发挥调控免疫、防控疾病等作用。中性菌和病原菌通过分解代谢产生有毒物质如内毒素等破坏肠道黏膜屏障功能并协同病原菌进入循环系统损伤组织器官[11-12]。生理状态下，这些肠道菌群数量和种类处于动态平衡状态，与宿主肠道协同形成生理屏障以阻止肠道有害物质进入循环系统，通过调控营养和能量物质代谢、免疫炎症反应和基因表达，参与机体多种生理过程[13-16]。近年来研究认为肠道菌群与慢性肾脏疾病、心力衰竭等疾病密切相关[17-18]。在CRI状态下，一方面尿毒症毒素不仅可以直接损伤肠道粘膜屏障功能，还可对肠道菌群的组成、功能和代谢产生严重影响；另一方面，以IS为代表的尿毒素进入循环进一步加重CRI。

IS主要是由以大肠杆菌为主的肠道菌群通过分解代谢色氨酸生成吲哚，由微生物氧化酶氧化生成吲哚酚，最终通过肝内磺化反应生成进入循环并通过肾脏代谢排出[5]。在CRI条件下，随着肾功能的恶化，IS大量蓄积于体内[6]。本研究结果发现相对于假手术组，5/6肾脏大部分切除术制备的CRI大鼠血浆IS浓度升高，心功能指标如LVEF、LVMI和E/e′升高，IS浓度与LVEF负相关(r=-0.423，P=0.007)、与LVMI(r=0.794，P<0.001)和E/e′(r=0.507，P=0.001)正相关，进一步提示IS对左室收缩功能和舒张功能均产生损害。病理结果显示：相对于假手术组，CRI大鼠心肌间质纤维化比例、心肌细胞横截面积均显著增加，IS浓度与心肌间质纤维化比例、心肌细胞横截面积均存在正相关。相关研究显示IS能够有效促进心肌成纤维细胞纤维化、心肌细胞肥大[5-10]。本研究结合相关研究结果提示CRI大鼠存在舒张功能障碍，IS可能是CRI心脏功能损害的重要媒介。

miR-34a具有促进心肌细胞凋亡、抑制心肌细胞肥大，促进心肌成纤维细胞纤维化等作用[19-21]。在本研究中，CRI大鼠心肌组织miR-34a表达升高，与血浆IS浓度正相关(r=0.893，P<0.001)，提示IS的心脏损伤作用可能与miR-34a相关。NLRP3炎症小体是心肌细胞肥大、心肌纤维化的重要调控分子[22]。已有研究证实IS能够上调心肌组织NLRP3、IL-1β表达[10]，本研究发现血浆IS与心肌组织NLRP3、IL-1β表达呈正相关。以上研究提示血浆IS可能通过促进心肌组织NLRP3炎性小体表达加剧心肌损伤。目前对于心肌组织NLRP3炎性小体与miR-34a表达之间的关系尚不清楚，仍需要进一步进行探讨。

综上，本研究发现血浆IS与CRI大鼠心功能损伤、NLRP3炎性小体表达、miR-34a表达等密切相关，提示IS可能通过NLRP3炎性小体、miR-34a促进CRF心功能损伤。