牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立

王 旭 ，孙 雨 ，王睿男 ，肖 颖 ，蒋 菲 ，毕一鸣 ，李 硕 ，杨 林 ，董 虹，宋晓晖，王传彬

（1.北京农学院，北京 102206；2.中国动物疫病预防控制中心，北京 102600；3.重庆动物疫病预防控制中心，重庆 400000）

口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）引起的猪、牛、羊等偶蹄动物发生的急性、热性、高度接触性动物传染病，目前已知该病有65个以上的亚型。牛尤其是犊牛对口蹄疫病毒最易感。本病在犊牛群中具有发病流行快、传播广、发病急、危害巨大等特点，疫区发病率可达50%以上，甚至100%，犊牛死亡率较高，其他牛死亡率则较低。病牛和潜伏期牛是最危险的传染源，患病牛的临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤等部位发生水疱性皮疹，临床上需注意该病与牛恶性卡他热的鉴别。病牛的水疱液、食道-咽部分泌物、乳汁、尿液、口涎、粪便和泪液等均含有口蹄疫病毒。该病主要通过消化道感染动物，也可经呼吸道传染，以春秋两季较为流行，尤其是春季发病较多。该病传播途径多、速度快，在世界范围内多次暴发流行。鉴于此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类传染病之首。目前，一半以上的OIE成员国流行FMD，无FMD国家和地区的畜产品贸易和家畜安全遭受巨大威胁。因此，开展口蹄疫野毒感染抗体的血清学鉴别诊断技术研究，在预防、控制、扑灭和净化该病方面具有重大意义［1］。

近几年，国内外学者对口蹄疫病毒的非结构蛋白3A、3B、3AB、3C、3ABC 以及 2B、2C 等片段做了详细的免疫学研究，建立了多种血清学检测方法［2-4］。其中一些方法非常适用于鉴别诊断口蹄疫野毒感染和疫苗接种免疫动物产生的抗体。目前，多项研究表明，用重组蛋白技术表达的3AB、3B、2C和3ABC均可作为ELISA方法的包被检测抗原，用于区分口蹄疫野毒感染和接种免疫产生的抗体［5-9］。目前已经有报道关于利用FMD非结构蛋白 2B、2C、3A、3B、3AB、3ABC 联合 3AB 蛋白等而发展的ELISA方法［10-12］。国内与国际上也有较多的商品化口蹄疫非结构蛋白ELISA方法检测试剂盒。其中3ABC蛋白由于具有较高的免疫原性以及其抗体在体内持续时间较长而被广泛应用于免疫研究［13-14］。如何选择结构表位优势突出、抗原性强、抗原指数高、亲水性强的序列片段，选择合适的抗原表达载体和酶切位点，构建可溶性表达载体并且优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期以来一直研究的热点课题［15-20］。时间分辨免疫荧光分析法（TRFIA）使用荧光元素标记代替传统的酶标记技术，是非常具有潜力的一种发光标记免疫分析方法。该技术通常使用铕（Eu3+）、镝（De3+）、铽（Te3+）、钐（Sm3+）等发光元素代替传统的酶等发光物质，延长了荧光寿命，降低了本底因素影响，敏感性和特异性都有了显著提高。目前，该方法在人类健康指标以及传染病诊断检测方面应用范围较广，但在重大动物传染病诊断检测领域开展的研究很少，市场上尚无任何注册产品。本研究利用DNA重组技术与重组抗原表达技术，在大肠杆菌pET-32a载体中高效表达了口蹄疫非结构蛋白3A-3B可溶性抗原，并以此重组抗原作为检测包被抗原，与其他相关试剂组合后制备了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析试剂盒，用于牛血清中口蹄疫非结构蛋白3A-3B抗体的检测，并且评价了试剂盒的各项应用指标，由检测结果判定被检动物是否感染口蹄疫病毒，具有较高的临床实用价值和推广价值。

1 材料与方法

1.1 材料

表达菌BL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司；pET-32a融合表达载体购自Novagen公司；所用酶和试剂：T4DNA连接酶，限制性内切酶NdeI、XhoI，2000 DNA Marker，IPTG、SDS均购自宝生物（大连）工程有限公司；DNA Extraction Kit、质粒快速提取试剂盒、DNA快速纯化回收试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司；融合蛋白目的基因的合成由华大基因生物科技有限公司完成；口蹄疫非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒购自国内市售品牌；重组大肠埃希氏菌pET-32a-（3A-3B）-BL21（DE3）株、口蹄疫非结构蛋白单克隆抗体细胞株均由中国动物疫病预防控制中心鉴定、保管和供应；脱脂奶粉购自美国Oxoid公司；酶标板购自美国Costar公司；铕标记元素（Eu3+）购自广州达瑞生物技术股份有限公司生产；阴性与阳性样本血清由中国动物疫病预防控制中心（农业农村部兽医诊断中心）保存。Auto-DELFIA1235时间分辨荧光检测仪购自PerkinElmer股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因片段的获得 根据NCBI网站口蹄疫病毒3ABC基因序列，使用化学合成的方法分别合成了口蹄疫病毒的3A-3B融合表达目的基因序列。

1.2.2目的基因扩增与融合 根据口蹄疫病毒3A-3B基因的序列设计1对引物，并分别在引物的5'端添加BamHI和3'端添加XhoI酶切位点，用于目的片段的扩增。

上 游 引 物 FMDV-NF：ggatccATTTCAATCCCTTCCC AGAAG；

下游引物FMDV-NR：ctcgagTTCCTTCACGACGGGGA CTTTT。

1.2.3 重组蛋白可溶性诱导表达条件的建立 将口蹄疫3A-3B目的基因序列连入pET-32a表达载体中构建重组表达质粒，并将上述鉴定的重组表达质粒转化至感受态菌E.coliBL21（DE3）中，挑取阳性克隆，37℃培养过夜。将菌液以1∶100接种于含氨苄青霉素（50 μg/mL）的液体 LB 培养基中，37℃、200 r/min培养至OD600值为0.4～0.6时，取出l mL未诱导的菌液作为对照，其余液体中加入异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白的表达。经过对温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化，最终确定蛋白高效可溶性诱导表达条件为：0.75 mM的IPTG浓度，过夜诱导13 h大量表达后，4℃、8 000 r/min离心30 min，收集菌体。经过高压大规模破碎菌体后，4℃、16 000 r/min离心30 min，收集上清。

1.2.4 重组蛋白3A-3B的表达与纯化

1.2.4 .1 树脂的预处理 吸取1 mL NiSepharoseTM 6 Fast Flow树脂，用10倍树脂体积的纯水洗树脂3次，用10倍树脂体积的10 mmol/L咪唑缓冲液洗树脂2次。让树脂自然沉降，弃废液。

1.2.4 .2 挂柱 将1.2.4.1中制备上清穿过树脂柱，重复5～7次。

1.2.4 .3 重组蛋白的洗杂和洗脱 依次用浓度为10、20、40、60、80、100、200 及 500 mmol/L 咪唑缓冲液对重组蛋白进行洗杂和洗脱。

1.2.4 .4蛋白的收获 收集洗脱液浓度为100、200和500 mmol/L洗脱产生的滤液，将500 mmol/L洗脱产生的滤液通过GE公司生产的Superdex200凝胶柱分子筛进行进一步精细纯化，最后将纯化后的蛋白吸出，加到透析袋中（8 KD），浸泡在2 L的透析液中过夜透析，置于-70℃以下的冰箱保存。

1.2.5 纯化后蛋白的抗原性分析（Dot-ElISA）检测 使用DAB染色法，将表达与纯化后的3A-3B抗原分别与牛口蹄疫病毒3ABC抗体阳性血清进行孵育，观察血清孵育的NC膜在抗原相应分子量区域没有明显的斑点。

1.2.6 铕标记抗体结合物的制备

1.2.6 .1兔抗牛二抗的预处理 将一定量的兔抗牛二抗加至50 KD截留分子量的超滤管中，9 000 r/min离心5 min，弃滤液。加入200 μL标记缓冲液，9 000 r/min离心5 min，弃滤液，再加入200 μL标记缓冲液，按上述方法离心（9 000 r/min离心5 min），此步骤重复6次，最后一次离心完毕后，控制终体积在150～200 μL之间，把超滤管取出，弃掉滤液，翻转滤管于新的收集管中，8 000 r/min离心2 min，收集所得滤液。

1.2.6 .2兔抗牛二抗的标记 按照标记1 mg二抗需要0.2 mg DTTA-铕NA标记试剂，按质量比为5∶1，将待标记抗体和标记试剂充分混匀，置于摇床上25℃孵育过夜。

1.2.6 .3铕标记兔抗牛二抗的纯化 用SephadexTM G-50柱凝胶层析柱纯化，具体步骤如下：①将Sephadex TM G-50填料，与水混匀装柱。用纯化柱平衡缓冲液对柱子进行处理，流速控制在1 mL/min，洗5个柱体积，使其pH值达到7.8，即可准备上样。②柱子平衡好后，取下柱子上端阀口，待柱中液面降至凝胶柱平面时，吸取样品缓慢加入到柱子内，注意不要破坏柱平面，等液面稍沉降后，加入1 mL纯化柱洗脱液，重新装好柱子。③用洗脱液洗脱，流速控制在1 mL/min左右，待抗体检测已显示出现蛋白峰（OD280）时，开始收集样品，每管1 mL。④标记物收集后，每管取5 μL加入96孔酶标板中，再加入200 μL增强液，在振荡器上振荡5 min后测荧光值，收集荧光值较高的几管。

1.2.6 .4 铕标稀释液的配制 Tris-base 30.3 g，NaCl 45 g，NaN35 g，Tween-20 0.5 mL，脱脂奶粉 25 g，酪蛋白 16 g，调节pH值至7.8，充分混匀，定容到500 mL，0.22 μm过滤。4℃保存。

1.2.6 .5铕标结合物的配制 将铕元素标记的兔抗牛二抗用铕标稀释液稀释至1 μg/mL。按不同规格要求无菌定量分装，贴加标签。

1.2.6 .6 标记物的保存 合并收集的标记物后，利用BCA法检测标记抗体的浓度，然后加入10%BSA至终浓度为0.1%，混匀，测定浓度。注明标记物名称、标记日期等信息后置于-20℃保存。同样工艺连续标记3批，批号分别为18-01、18-02和18-03。

1.2.7 3A-3B抗原的包被和封闭 包被：将纯化的口蹄疫病毒3A-3B抗原用pH值9.6碳酸盐包被液从8 μg/mL梯度稀释至 0.5 μg/mL，每孔 100 μL加入 Costar的ELISA 酶标板中，2～8℃放置 12～16 h；封闭：取出包被板，用PBST洗涤3次，用5%脱脂奶封闭，每孔350 μL，37℃放置2 h，封闭后洗涤同上。用制备好的各浓度反应板分别检测阴性对照和阳性对照，加入梯度稀释的铕标记兔抗牛二抗反应，比较荧光检测值以及阴性对照荧光值/阳性对照荧光值结果，选取比值最大的包被浓度，作为抗原最佳包被浓度。

1.2.8 铕标记兔抗牛二抗最适工作浓度的确定 在口蹄疫病毒3A-3B抗原包被板中加入阴性对照和阳性对照，用铕标稀释液将铕标抗体结合物从1∶2 000稀释至1∶32 000 μg/mL，分别加入反应板中，其他步骤按常规操作，比较荧光检测值及阴性对照荧光值/阳性对照荧光值结果，选取标准阳性对照检测值50 000左右、且P/N值最大的铕标记结合物工作浓度，作为铕标记抗原的最适工作浓度。

1.2.9 样品稀释度的确定 在制备好的反应板中分别加入倍比稀释的阴性和阳性牛口蹄疫病毒3ABC抗体血清样品，在其他条件相同的情况下，进行时间分辨荧光免疫分析检测，选择阳性值最高且P/N值最大的稀释度。

1.2.1 0抗原最佳反应时间选择 在制备好的反应板中加入4组阴阳性血清对照，按已经确定的程序操作，在室温条件下分别振荡反应 30min、60min、90min、120min，在其他条件相同的情况下，进行时间分辨荧光免疫分析检测，取P/N值最高且用时最短的作用时间确定为最佳反应时间。

1.2.1 1阴阳性临界值的确定 采用建立的时间分辨荧光免疫分析检测方法对400份牛阴性血清进行检测，测定荧光检测值、400份阴性血清平均值x与标准差SD值，并计算阴阳性临界值x+3SD的荧光值。按照S/N公式：S/N=（临界荧光值-阴性质控血清荧光值）（/阳性质控血清荧光值-阴性质控血清荧光值），计算检测方法判定阴阳性临界值的S/N值。

1.2.1 2 特异性试验 用样品稀释液按照1∶50分别对牛传染性鼻气管炎抗体阳性血清、牛病毒性腹泻抗体阳性血清、大肠杆菌阳性牛血清、牛布鲁氏菌病抗体阳性血清进行稀释。

1.2.1 3敏感性试验 将牛口蹄疫病毒3ABC抗体阳性血清用样品稀释液按照 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800 和 1∶25 600 进行倍比稀释，采用建立的时间分辨免疫荧光分析法进行检测，同时采用Procheck的3ABC抗体检测试剂盒作为比较，得出阳性临界值时的最大稀释度。

1.2.1 4重复性试验 采用建立的快速定量检测方法对10份牛血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数（CV）。

1.2.1 5符合性试验 采用建立的时间分辨检测方法与Procheck公司生产的3ABC抗体诊断试剂盒对送检的300份血清进行检测，计算其符合率。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE分析结果

分别取处理后的试验组样品、对照组样品及蛋白分子量Marker进行SDS-PAGE电泳试验，结果表明，重组大肠埃希氏菌 pET-32a-（3A-3B）-BL21（DE3）能诱导产生3A-3B蛋白，且诱导后产生的蛋白大部分为可溶性蛋白，结果详见图1。

图 1 pET-32a-（3A-3B）-BL21（DE3）株菌种诱导表达产物SDS-PAGE分析

2.2 纯化后蛋白的抗原性分析（Dot-ElISA）检测结果

经DAB显色后，重组大肠埃希氏菌pET-32a-（3A-3B）-BL21（DE3）株菌种蛋白与阳性血清孵育的NC膜在抗原相应分子量区域分别出现一个明显的斑点，而在其他区没有斑点；阴性血清孵育的NC膜在抗原相应分子量区域没有明显的斑点，详见图2。

图2 3A-3B重组蛋白的抗原性分析（Dot-ELISA）检测结果

2.3 3A-3B抗原最佳包被浓度与铕标二抗最佳稀释浓度的选择

当3A-3B抗原包被浓度为2 μg/mL、铕标二抗稀释度为1∶8 000时，标准阴阳对照的P/N值最高。因此，确定3A-3B抗原的最佳包被浓度为2 μg/mL，铕标二抗 稀释度为1∶8 000，见表1。

表1 3A-3B抗原包被浓度及铕标二抗工作浓度选择

2.4 样品稀释度

对3种样品不同稀释度结果进行比较，最终确定牛血清样品50倍稀释检测阳性值最高，且阴阳差异（P/N值）最大，见表2。

表2样品稀释度的确定

2.5 待检抗体反应时间选择

对待检抗体不同反应时间结果进行比较，最终确定P/N接近最大而反应时间相对较短的室温振荡60 min为最佳反应时间，见表3。

表3待检抗体的最佳作用时间

2.6 铕标二抗反应时间选择

对铕标抗原不同反应时间结果进行比较，最终确定P/N最大且反应时间较短的室温振荡30 min为最佳反应时间，见表4。

表4铕标二抗工作时间的确定

2.7 时间分辨荧光免疫分析检测方法阴阳性临界值确定

采用建立的时间分辨荧光免疫分析检测方法对400份牛阴性血清进行检测，测定荧光检测值、400份阴性血清平均值x与标准差SD值，并计算阴阳性临界值x+3SD的荧光值。按照S/N公式：S/N=（临界荧光值-阴性质控血清荧光值）（/阳性质控血清荧光值-阴性质控血清荧光值），计算阴阳性临界值的S/N值为0.2。即当样品S/N值≥0.2时，判定样品为阳性；当S/N值<0.2时，判定样品为阴性。

2.8 特异性试验

时间分辨荧光免疫分析方法对牛传染性鼻气管炎抗体阳性血清、牛病毒性腹泻抗体阳性血清、大肠杆菌阳性牛血清、牛布鲁氏菌病抗体阳性血清进行检测，结果表明，该方法对各血清的检测结果均为阴性，详见表5。

表5时间分辨荧光免疫分析方法对特异性血清的检测结果

2.9 敏感性试验

用所建立的时间分辨荧光免疫分析检测方法分别对不同稀释度的口蹄疫病毒强阳性血清、阳性血清和弱阳性血清进行检测。结果表明，3批试剂盒对强阳性血清的最低检出限均为1∶1 600，对阳性血清的最低检出限均为1∶800，对弱阳性血清的最低检出限均为 1∶400，结果见表6。

2.1 0重复性试验

以不同效价血清稀释50倍后做平行重复检测，结果显示，批内与批间重复变异系数均小于10%（表7）。结果表明，建立的时间分辨荧光免疫分析检测方法具有良好的重复性。

2.1 1符合性试验

分别用自制的和市售的试剂盒对300份临床样品进行检测，结果表明，口蹄疫3ABC抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法共检出阳性样品154份，阴性样品146份；市售试剂盒共检出阳性样品150份，阴性样品150份，两种试剂盒阳性样品的符合率96%，阴性样品的符合率93.3%，总符合率95.7%，符合率统计结果详见表8。

表6时间分辨荧光免疫分析检测方法对阳性血清的检测结果

表7时间分辨荧光免疫分析检测方法重复性试验

表8两种试剂盒对FMDV抗体检测符合率统计

3 讨论

牛口蹄疫与水泡性口炎、牛恶性卡他热的症状相似，临床不易区分，故应做实验室诊断鉴别。其方法是采集典型发病牛的水泡皮或者呼吸道-咽部分泌物，以pH 值 7.2～7.6 的磷酸盐缓冲液制成比例为 1∶5～1∶10 的研磨悬液，离心沉淀后取上清液接种牛、猪、羊等偶蹄动物以及马、乳鼠等动物，如果仅马不发病，其他动物都临床发病，出现典型临床症状，即可判定为牛口蹄疫。取牛呼吸道-咽部分泌物或者乳房、舌部和蹄部的新鲜水泡皮，加40%～60%的甘油生理盐水装入灭菌瓶内，送有资质的实验室开展病毒分离试验，是目前最为经典的确诊方法，但该方法费时费力，并且鉴定周期较长，较为繁琐。目前诊断牛口蹄疫病使用最为普遍的是基于FMDV非结构蛋白（3ABC）的ELISA鉴别诊断技术。

FMDV非结构蛋白检测的优点显而易见，首先检测血清中的非结构蛋白抗体可以用来区分疫苗免疫动物与野毒感染动物；其次非结构蛋白不分血清型，65个以上的亚型均可使用此方法进行诊断，因此，基于非结构蛋白的ELISA检测方法可以对口蹄疫的大部分血清型进行检测。本研究通过大量的试验筛选，选择了口蹄疫3ABC非结构蛋白序列中可以高效可溶性表达的3A-3B优势抗原序列片段作为目的诊断抗原。其中3A片段为非结构抗原3ABC中的截短片段，3B1（VPg1）与3B2（Vpg2）序列为3B位抗原序列中的两个亚基，这3个片段的融合表达不仅可溶性表达比例高，而且与口蹄疫3ABC全抗原相比，检测的敏感性相当，但3A-3B特异性更好，所以本研究选择3A-3B优势抗原序列片段作为目的诊断抗原。通过比对Pet28a、Pet30a、Pet32a、Pgex4-1载体对抗原的表达效果，Pet32a载体表达抗原量最高，融合抗原的可溶性表达比例也最高，最终选择Pet32a载体作为融合抗原表达载体。在酶切位点的选择方面，通过比较BamHI、XhoI、NdeI、XhoI、EcoRI、XhoI等酶切位点组合，选择BamHI、XhoI酶切位点组合可溶性融合抗原的表达量最高，最终选择Pet32a载体的BamHI、XhoI酶切位点组合进行抗原的表达。

与传统的FMDV的病毒分离、血清中和试验、ELISA等检测方法相比，时间分辨荧光免疫分析检测方法操作简便，判断结果敏感、特异、客观，并且可应用于全自动检测。同时，目前市场上销售的用于检测FMDV抗体的ELISA试剂盒主要依赖国外进口，价格十分昂贵，给基层兽医口蹄疫检测和监测工作的开展带来巨大困难。时间分辨荧光免疫分析法是一种新兴的荧光免疫分析方法，它利用了荧光的波长与其激发波长的差异，克服了普通紫外-可见分光分析法中非特异检测的影响，提高了检测的准确性与特异性。为克服铕标记的抗原荧光强度弱的问题，一般在试验反应体系中加入增强剂，可使铕元素从复合物上解离出来，解离的铕元素同增强剂螯合结合形成胶态分子团，胶态结合分子团能在紫外光的激发下发出强烈的荧光，信号强度获得了极大的放大。时间分辨荧光免疫分析检测方法相比较于传统酶免ELISA方法检测敏感性更高、特异性更强、信噪比更高、本底值更低、成本更低、操作简单易行、仪器小型化便于携带，适用于基层田间大量样品的快速定量检测，更适合于基层和田间对动物疫病的诊断。