大豆种子醇溶蛋白提取及SDS-PAGE体系优化

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

醇溶蛋白是存在于植物种子中的一种储藏蛋白，目前对于小麦、玉米、高粱等植物醇溶蛋白的提取及应用研究都有较多的报道[1-3]，但对豆类种子醇溶蛋白的相关研究较少。本实验采用2种不同的提取体系对大豆种子醇溶蛋白进行提取，并进行了SDS-PAGE体系的建立，旨在对豆类作物醇溶蛋白的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为垦农16大豆种子，市购。

1.2 实验方法

采用2个混合提取体系提取大豆种子醇溶蛋白，每一体系均采用正交试验，设计三水平四因素试验(见表1)，提取大豆醇溶蛋白。提取后采用考马斯亮蓝G 250法[4]测定体系中醇溶蛋白浓度。

提取体系Ⅰ：A.55 mL乙二醇+15 mL正丙醇；B.65 mL乙二醇+15 mL正丙醇；C. 75 mL乙二醇+15 mL正丙醇，各加蒸馏水至100 mL；

提取体系Ⅱ：A.55 mL乙二醇+25 mL正丙醇、B.55 mL乙二醇+35 mL丙醇、C.55 mL乙二醇+45 mL正丙醇，各加蒸馏水至100 mL。

电泳实验为SDS-PAGE体系[4]，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为10%，上样量为19μL。

表1 L9表

试管号固液比(g/mL)温度(℃)时间(h)提取液浓度(%)11(1∶10)1(30)1(1)1(A)21(1∶10)2(40)2(2)2(B)31(1∶10)3(20)3(3)3(C)42(1∶15)1(30)2(2)3(C)52(1∶15)2(40)3(3)1(A)62(1∶15)3(20)1(1)2(B)73(1∶20)1(30)3(3)2(B)83(1∶20)2(40)1(1)3(C)93(1∶20)3(20)2(2)1(A)

2 结果与分析

2.1 大豆醇溶蛋白提取分析

图1是提取体系Ⅰ提取大豆种子醇溶蛋白实验结果，通过各因素对大豆种子醇溶蛋白提取的极差计算可知，4种因素对于提取的影响是不同的，其中对于提取有较大影响的因素是提取时间，影响较小的因素是提取温度，固液比和提取液浓度对提取的影响相差无几。图2是提取体系Ⅱ各因素对大豆种子醇溶蛋白提取的极差计算，与提取体系Ⅰ相同，4个因素中同样表现出提取时间对醇溶蛋白提取有较大影响，而温度对于提取的影响较小。

图1 提取体系Ⅰ提取大豆醇溶蛋白各因素极差

图2 提取体系Ⅱ提取大豆醇溶蛋白各因素极差

2.2 SDS-PAGE分析

图3、图4分别是2个不同提取体系提取大豆醇溶蛋白SDS-PAGE图谱，上样量均为19μL。提取体系Ⅰ的电泳图谱中每1个泳道条带均较清晰，差别不大。而提取体系Ⅱ的电泳图谱则表现出不同的泳道有所不同，并且清晰度较差。

图3 提取体系Ⅰ电泳图谱

图4 提取体系Ⅱ电泳图谱

3 讨论与结论

醇溶蛋白被定义为可以溶于乙醇等醇类物质的一类蛋白，通常是由分子量为30～90 kDa不同的亚基所构成[5]。不同作物种子中所含的醇溶蛋白有不同的亚基构成及结构，因此在不同体系中溶解性是不同的。对于大豆种子醇溶蛋白的提取所设置的4个因素中，2个提取体系均表现为提取时间为较大影响因素，而提取温度为较小影响因素，与之前的研究有所不同[6]。

在先前的研究中发现，大豆种子醇溶蛋白在不同的提取剂中有不同的溶解性，其中用乙二醇提取大豆种子醇溶蛋白后进行SDS-PAGE效果较好[6]。本次研究采用了混合体系对大豆种子醇溶蛋白进行提取，其中包括2种物质：乙二醇和正丙醇。提取体系Ⅰ中正丙醇含量不变，均为15 mL，乙二醇含量分别为55，65 mL和75 mL；提取体系Ⅱ中乙二醇含量不变，均为55 mL，正丙醇分别为15，25 mL和35 mL，结果显示，提取体系Ⅰ提取大豆醇溶蛋白SDS-PAGE效果较好，而提取体系Ⅱ提取大豆种子醇溶蛋白SDS-PAGE效果不佳。因此认为，正丙醇的浓度对大豆种子醇溶蛋白的提取及SDS-PAGE有一定的影响，在一定的提取体系中正丙醇浓度相对较小的情况下有利于大豆种子醇溶蛋白的提取及SDS-PAGE，而正丙醇浓度相对较高时则不利于大豆种子醇溶蛋白提取及SDS-PAGE体系的优化。