新疆高尿酸血症痰浊阻滞证患者炎性因子外周血基因表达水平及相关性研究

马丽丽，王先敏

(1.新疆医科大学，乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学附属中医医院科研科，乌鲁木齐 830000)

高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)主要是由于嘌呤代谢障碍从而引起尿酸排泄减少或过度产生所导致的一种疾病[1]，其与代谢性疾病，如高脂血症、肥胖、代谢综合征、糖尿病及心血管疾病等均有密切联系[2-3]。调查研究显示，HUA患病人群在美国占5%～10%，而接近17.1%的亚洲女性及26.1%的亚洲男性患有HUA，并且呈年轻化发展趋势[4]。

相关报道的数据显示，HUA患者体内存在微炎症状态,从遗传的角度讲，HUA的发生、发展与一些炎症信号转导通路产生的关键细胞因子的激活和(或)抑制作用有关，炎性因子长期发展会使微炎症HUA逐渐向痛风性关节炎发展，从而降低患者的生活质量[5]。研究表明，炎症信号通路髓样分化因子88(myeioid differentiation factor 88,MyD88)/核因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)中下游的关键核因子及促炎性因子MyD88、NF-κB、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及白细胞介素(interleukin,IL)-1β等在痛风炎症表现中的作用显著[6]。然而，作为痛风发病的病理基础，HUA炎症反应的发展是否与这一系列促炎因子相关，具体机制尚未完全明确阐述。前期流行病学调查发现，痰浊阻滞证是新疆地区维吾尔族、汉族HUA患者中分布最广的证型，对HUA患者日常的饮食、睡眠、情绪等影响较大[7-8]。痰湿体质的发生、发展同样与炎性因子的表达密切相关[9]。因此本研究主要检测中HUA痰浊阻滞证与非痰浊阻滞证患者外周血中促炎性因子MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β的基因表达水平差异，以期发现上述炎性因子在微炎症HUA痰浊阻滞证中的表达水平及与血尿酸水平的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取新疆医科大学附属中医医院2014年4月至2015年8月收治的74例HUA患者作为研究对象,根据HUA中医证型诊断标准不同分为痰浊阻滞证组和非痰浊阻滞证组。痰浊阻滞证组48例，男41例，女7例，年龄36～70岁，平均(55±9)岁；体质指数22.0～38.7 kg/m2，平均(27.18±0.54)kg/m2；非痰浊阻滞证组26例，男11例，女15例，年龄37～70岁，平均(57±9)岁；体质指数21.3～34.6 kg/m2,平均(26.80±0.23)kg/m2。两组患者性别、年龄、BMI比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过新疆维吾尔自治区中医医院医学伦理学委员会审查，患者均签署知情同意书。

1.2HUA及中医证型诊断标准

1.2.1HUA诊断与排除标准 血尿酸水平：男性>420 μmol/L,女性>360 μmol/L[10]。排除患有肾脏病变、痛风石、急/慢性痛风性关节炎的HUA人群；排除患有精神病、严重肝、心脑血管、肿瘤疾病的HUA人群。

1.2.2中医证型诊断标准 痰浊阻滞证：伴有头重如裹、神疲乏力、头身困重、心悸、烦躁易怒、眩晕、胸闷气憋、咽干口燥、健忘、头目胀痛、口苦、口黏腻、浮肿、失眠等中任意6项即可诊断。非痰浊阻滞证：①气虚证，伴有自汗、盗汗、多梦等任意2项症状可诊断；②肾虚证，伴有畏冷肢凉、腰痛、膝酸软、腰酸、夜尿多等任意3项症状可诊断；③脾虚证，伴有唇甲色淡、面色萎黄、关节红肿、食欲不振等任意3项症状可诊断；④湿热证，伴有便秘、肠鸣矢气、小便短黄等任意2项症状可诊断；⑤水湿停留证，伴有形体肥胖、面色紫暗、胃肠水声辘辘、唇色紫暗等任意3项症状可诊断[10]。

1.3方法

1.3.1血液标本的采集以及生化指标检测 在禁止进食12 h后采集2 mL静脉血，将全血样本1 000×g离心20 min收集上清，放置-20 ℃冰箱备用。干化学法测定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、肌酐、尿酸。

1.3.2反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测仪器与方法

1.3.2.1主要实验仪器 全自动血液分析仪(日本Sysmex,XT-2000i)；全自动生化分析仪(中国TOSHBIBA公司,AU680)；恒温箱(上海医用恒温设备厂，FYL-YS-100L)；台式高速冷冻离心机(美国Thermo公司,pic-17 75002416)；涡旋混合器(中国SCuLOGEX公司,HW-80A)；荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司,iQ5)；凝胶成像检测仪(美国BIO-RAD公司,T100)；酶标仪(美国，Thermo公司赛默飞公司,MultiskanFC)。

1.3.2.2RT-PCR检测方法 ①提取样本总RNA：用Trizol法提取血液样本中总信使RNA。②RNA电泳检测：取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。③互补DNA逆转录合成、纯化：使用日本TAKARA公司AMV反转录酶按40 μL体系进行反转录，使用快速PCR纯化试剂盒进行互补DNA纯化。④目的基因PCR扩增：RT-PCR体系(25 μL)，每个目的基因重复3组，再加一组内参基因(GAPDH基因)，共7个基因组。循环过程：95 ℃解链预变性15 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共进行55个循环，最后保持在4 ℃左右。⑤结果计算：将MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因的CT值减去内参基因GADPH的CT值，得出差值(ΔCT)即为MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因的相对表达量。

2 结 果

2.1两组患者血清指标的比较 痰浊阻滞证组外周血的FBG、TC、肌酐高于非痰浊阻滞证组，HDL-C低于非痰浊阻滞证组(P<0.05或(P<0.01)，两组TG、LDL-C、尿酸比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组HUA患者血清指标的比较

HUA：高尿酸血症；FBG:空腹血糖；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；a为Z值，余为t值

2.2两组患者MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因表达的比较 痰浊阻滞证组外周血中MyD88、IL-1β基因表达水平低于非痰浊阻滞证组，NF-κB、TNF-α基因表达水平高于非痰浊阻滞证组(P<0.01)。见表2。

表2 两组患者MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因表达水平的比较 [M(P25，P75)]

HUA：高尿酸血症；MyD88:髓样分化因子88；NF-κB：核因子κB；TNF-α:肿瘤坏死因子α；IL-1β:白细胞介素1β

2.3痰浊阻滞证与非痰浊阻滞证中血尿酸与MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因相关性 痰浊阻滞证患者外周血NF-κB表达与尿酸呈负相关(r=-0.331，P=0.001)，IL-1β基因表达与尿酸呈正相关(r=0.274，P=0.006)，MyD88、TNF-α基因表达水平与尿酸无相关性(r=-0.092,P=0.366；r=-0.197，P=0.052)；非痰浊阻滞证中MyD88、NF-κB、TNF-α基因表达与尿酸呈负相关(r=-0.033，P<0.001；r=-0.150，P<0.001；r=-0.415,P<0.001),IL-1β基因表达水平与尿酸无相关性(r=0.013,P=0.144)。

3 讨 论

新疆地处西北边陲，一年中近大半年都处于寒冷气候中，其主体民族的维吾尔族从游牧时期开始至今，较汉族人群，喜食牛羊乳类及酒类等肥甘厚味、辛辣炙煿之品以抵抗寒冷。因此痰浊阻滞证成为新疆HUA的主要证型[11]。本研究结果显示，痰浊阻滞证患者中脂质代谢产物FBG、TC、肌酐高于非痰浊阻滞证，HDL-C低于非痰浊阻滞证组，这与血脂异常和HUA痰浊阻滞证关系密切的结论[7]一致。正如《素问·奇病论篇》：“肥者令人内热，甘者令人中满”，多食肥腻食物容易损伤脾胃，进一步减慢脾和胃的运化功能，从而对水谷精微物质的代谢失去一定的控制，促使痰湿及水饮在体内滋生，久郁化热，说明新疆民族独特的饮食习惯及气候环境是形痰湿体质的重要影响因素。

研究报道HUA的损伤存在炎症反应[12]，其原理主要是由于人体内尿酸盐大量沉积，久之形成结晶，引发受累关节红肿、热痛，从而引起炎性病变，促使HUA进一步向急性痛风性关节炎发展[13]。临床研究发现[14-15]，痛风炎症表现与介导代谢性疾病炎症的重要的一类促炎症分子密切相关，如MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β，这类促炎分子参与炎症的级联反应，促进痛风炎症发病[16-17]。本研究结果显示：痰浊阻滞证患者外周血中NF-κB 基因与尿酸呈负相关，IL-1β基因与尿酸呈正相关，非痰浊阻滞证中MyD88、NF-κB、TNF-α基因与尿酸呈负相关，表明HUA炎症反应可能与MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因相关，但在不同的中医证型中炎性因子MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β的基因表达水平与尿酸含量的相关性并不一致，为今后HUA不同中医证型的基因鉴别提供了可能的理论基础。NF-κB是Toll样受体4的下游因子,Toll样受体4被激活,导致下游的NF-κB活化增强,最终导致一系列炎性介质(IL-1β、TNF-α等细胞因子)大量释放,使HUA的微炎症状态加重。成熟的IL-1β被认为是急性痛风性关节炎和HUA时调节炎症的始动因素[18]：它通过激活IL-1受体使趋化因子和其他炎症调节因子发挥作用，导致大量中性粒细胞进入关节部位，促使HUA与急性痛风性关节炎的炎症产生和发展[19]。TNF-α是Toll样受体4/NF-κB信号通路下游的关键分子，可以激活磷脂酶A2，使中性粒细胞的吞噬活性增加，增加的中性粒细胞进行合成，释放TNF-α，TNF-α又反过来促进中性粒细胞聚集，并激活中性粒细胞产生多种炎性介质，它们相互作用、相互影响，加重组织的损伤和炎症，诱发HUA，提示NF-κB、TNF-α、IL-1β基因可能参与HUA的微炎症反应[20]。张剑勇等[21]通过研究发现，Toll样受体4的表达水平降低会抑制NF-κB的基因活性，削弱了直接致炎因子TNF-α基因的分泌水平。以往Criʂan等[22]研究表明，IL-1β基因表达随着血尿酸含量的增高而升高，两者呈正相关。本研究结果显示，痰浊阻滞证中IL-1β基因表达水平与尿酸呈正相关，与上述研究结果相符。而Zhu等[23]发现HUA合并糖尿病患者中TNF-α基因与血清尿酸水平呈正相关。本研究中非痰浊阻滞证患者TNF-α基因表达水平与尿酸呈负相关，与上述研究结果相反，其原因可能是TNF-α基因表达水平在急性痛风性关节炎与HUA中趋势相反，但均参与炎症反应。

HUA的痰湿体质中炎性因子也存在异常水平[16]。本研究结果显示，痰浊阻滞证组外周血中MyD88、IL-1β基因表达水平低于非痰浊阻滞证组，NF-κB、TNF-α基因表达水平高于非痰浊阻滞证组(P<0.01)。研究表明，TNF-α通过非p53依赖途径促进NF-κB mRNA的表达升高[24]。由于HUA是痛风的病理基础，童晓霞[25]研究发现痛风患者体内IL-1β基因表达显著高于正常组。伴有湿痰阻络症的急性痛风性关节炎大鼠踝关节液中IL-1β、TNF-α基因表达较正常组显著降低，进一步说明IL-1β、TNF-α基因在痰浊阻滞证的痛风及HUA中低表达[26]。

综上所述，MyD88、NF-κB、TNF-α及IL-1β基因表达水平在痰浊阻滞证与非痰浊阻滞证患者外周血的显著差异为新疆微炎症HUA的主要证型的基因鉴别提供了可能的理论依据。但由于本试验样本保存不当，日期过长，剔除后，所选取样本量较小，故新疆的代表性不明显，后续试验需要加大样本量，以发现此类促炎因子在新疆HUA炎症反应的发生、发展中可能的作用机制。本研究为HUA微炎症痰浊阻滞证的不同发病机制提供了可能的理论依据，也为新疆地区独特的痰浊阻滞证型发病机制研究提供了思路和良好的基础。