1例家族性地中海热患儿临床特征及基因突变分析

杨莉莉，曹广海△，李东晓，张耀东，刘翠华

(1.郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院肾脏风湿科,郑州 450018；2.河南省儿童遗传代谢性疾病重点实验室，郑州 450018)

家族性地中海热(FMF)是一种自身炎症性疾病，其临床特点是不定期反复发热，一般持续0.5～3.0 d后自行缓解，并伴有浆膜炎、淀粉样变、关节炎、腹膜炎及非淀粉样肾小球病[1-2]。少数病例只有发热这1个症状[3]。该病致病基因为MEFV(MIM 608107)，遗传方式有常染色体显性遗传(MIM 134610)和常染色体隐性遗传(MIM 249100)，其中以常染色体隐性遗传较为常见[4]。FMF在地中海沿岸人群中发病率高，以往亚洲及其他地区人群中报道较为少见，但自2002年日本首例FMF报道以来，亚洲地区对该病的认识也逐渐加深，我国近年也零星报道了一些儿童及成人的FMF病例[3,5-6]。

MEFV基因位于16号染色体短臂上，有10个外显子，最常见的MEFV基因变异有5种：10号外显子上的p.M680I、p.M694V、p.M694I和p.V726A及2号外显子上的p.E148Q，这些变异占到了FMF中的65%～95%[7-8]。本文报道1例FMF患者，其携带有常见的p.E148Q变异，另外携带1个内含子变异，虽然该变异已经被收录于自身炎症性疾病基因数据库-Infevers中，但是该位点在非阿拉伯人群中未见报道，同时在国内也是首次报道[9]。本研究丰富了国内该病的基因突变位点数据库，为该病的遗传咨询、产前诊断及治疗提供了更多的依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 患儿，男，13岁，以间断发热4+年为主诉入院。4年前患儿无明显诱因出现发热，热峰40 ℃，热前有畏寒、无寒战、咳嗽、惊厥、吐泻、皮疹、腹痛和腹泻等，口服退烧药可降至正常。之后每2周至1个月发热1次。期间分别在当地医院和诊所治疗，给予阿奇霉素、头孢他啶、头孢哌酮钠舒巴坦钠等抗感染治疗，患儿体温无明显好转，发热持续1～7 d，发热期间无其他伴随症状，精神状态好，饮食睡眠正常，大小便正常。既往体质可，3年前行扁桃体切除术，无传染病史，无食物、药物过敏史和输血史，预防接种史随当地，个人史无特殊。家族史：父母及姐姐体健。患儿爷爷十几岁时曾有3年时间经常发热，每次发热几天，均未给予特殊治疗，体温能自行降至正常，14岁后体温完全正常，未再有类似症状，其余家族成员无相关病史。查体：身高162 cm,体质量49 kg，生长发育正常。神志清，精神一般，全身皮肤黏膜无皮疹、黄染及出血点。浅表淋巴结无肿大。心、肺、腹查体无明显异常，神经系统检查阴性。血常规：白细胞5.48×109/L，中性粒细胞比例 62.8%，淋巴细胞比例30.8%，血红蛋白122 g/L，血小板 311×109/L；C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)正常，外周血涂片未见异常形态血细胞。血液生化检查未见异常，尿常规、大便常规、凝血功能未见异常，淋巴细胞亚群未见明显异常。免疫球蛋白(Ig)：IgG 5.51 g/L，IgM 0.92 g/L，IgA 0.58 g/L。补体C3、C4正常；类风湿因子(1.0 IU/mL)正常；铜蓝蛋白 84.66 mg/dL，EB病毒(EBV)及巨细胞病毒(CMV)-DNA定量均为阴性；半乳甘露聚糖小于0.1 μg/L，真菌D-葡聚糖小于10 pg/mL；抗链球菌溶血素“O”抗体正常，结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)未见异常，血培养、脑脊液常规、生化、培养均未见异常，呼吸道病原均为阴性，红细胞沉降率 64 mm/h，自身抗体谱、中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)谱、抗心磷脂抗体、类风湿因子均为阴性，甲胎蛋白、神经元特异性烯醇化酶、癌胚抗原等肿瘤标记物均正常，骨髓细胞学检查未见异常，心脏彩超、腹部彩超未见异常，头颅、胸部、双肾上腺CT平扫均未见异常。

1.2方法

1.2.1基因筛查 本研究经医院医学伦理委员会批准，征得患儿监护人知情同意后，入院3 d时抽取患儿外周血约2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，混匀后，将样品送至北京迈基诺医学检验所检测，使用靶向捕获技术(GenCap Enrichment Kit,Mygenostics)和高通量测序(Illumina HiSeq 2500)技术进行免疫相关基因筛查。测序数据利用BWT算法与UCSC数据库提供的人类基因组参考序列(hg19)进行比对，同时对目标区域的覆盖度和测序质量进行评估。通过ClinVar、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)和人类基因突变数据库(HGMD)等查找变异位点或疑似致病突变的收录情况，进行基因突变致病的注释。

1.2.2家系分析 对患儿进行二代测序送检的同时，抽取患儿父母外周血约2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，混匀后，将样品送至北京迈基诺医学检验所检测。根据高通量测序的分析结果，使用Primer 6.0软件设计MEFV基因2号外显子和5号内含子的扩增引物。经过PCR，产物切胶纯化后待用。纯化的PCR 产物在全自动测序仪ABI3500上进行双向测序，测序结果用Chromas 2.41软件分析，并在NCBI数据库中序列比对检索工具(BLAST)与正常序列(NG_007871.1)进行比对分析。

2 结 果

2.1诊疗过程 该患儿仅有反复发热1项临床表现，临床表现不典型，院外多次行抗感染、抗炎治疗效果欠佳，入院后除外感染性、风湿性疾病、免疫缺陷病、血液系统疾病和肿瘤等因素后，结合患儿祖父曾有反复发热病史，考虑遗传相关的自身免疫性疾病可能，进行靶向捕获测序，筛查致病基因。

2.2基因检测结果 通过高通量测序技术进行免疫相关基因筛查，检测平均测序深度182X，目标捕获区域30X覆盖率为93.1%，Q30为96%，视为测序质量合格。高通量测序结果显示，患儿基因组中的MEFV 基因具有c.442G>C(p.E148Q)和c.1588-69G>A复合杂合变异，经Sanger测序家系验证(图1)，前一变异遗传自母亲，后一变异遗传自父亲。基因检测结果显示，患儿父亲的MEFV检测结果为：c.442G>C(杂合)、c.1588-69G>A(纯合)；其母亲的MEFV检测结果为：c.442G>C(纯合)、c.1588-69G>A(杂合)。HGMD数据库根据变异位点和疾病的关联程度等信息对位点进行分类：(1)致病突变(DM)；(2)疑似致病突变(DM？)；(3)疾病相关的多态性变异(DP)；(4)有功能证据支持的疾病相关多态性变异(DFP)；(5)体外/实验室或体内功能的多态性变异(FP)；(6)移码或截断变异(FTV)。c.442G>C在HGMD数据库中的分类为DP，c.1588-69G>A的分类为DM。

2.3治疗及随访 基因确诊，家长签署知情同意书后，初始给予该患儿秋水仙碱每次0.5 mg，1天1次口服(合0.01 mg·kg-1·d-1)。服药4周后患儿至本院门诊复诊，期间发热1次，体温39.0 ℃，仅1次，口服布洛芬混悬液后降至正常。发热时无咽痛、咳嗽、皮疹等表现，服药期间未出现皮疹、恶心、呕吐等不适。复查肝肾功能、血常规、CRP均正常，红细胞沉降率50 mm/h。遂调整秋水仙碱每次0.5 mg，1天2次口服(合0.02 mg·kg-1·d-1)，患儿每1～2个月门诊随访1次，均未再发热，服药第6个半月时复查红细胞沉降率将至正常。

A:c.442G>C测序图；B：c.1588-69G>A测序图。箭头标出的位置为突变位点

图1 Sanger测序结果

3 讨 论

FMF多见于地中海地域的人群，如阿拉伯人、土耳其人和亚美尼亚人等，在土耳其的患病率约为1∶1 000[10]。该病在非地中海地域的人群中报道较少，且临床表现常不典型。虽然中国的病例并不多见，但是在日本，FMF已经不再被认为是罕见病[11]。因此提高国内医生对该病的认识，对防止误诊误治至关重要。

1997年Tel Hashomer标准被提出以后，就成为最普遍的FMF诊断标准之一，其包括4项主要标准，5项次要标准和10项支持准则。满足以下4种情况即可诊断：(1)符合1项主要标准；(2)符合2项次要标准；(3)1项次要标准加5项支持准则；(4)1项次要标准加前5项支持准则中的4条[12]。Tel Hashomer标准是以犹太成年人的患病指标建立的，因此对于儿童诊断特异性较差[13-14]。YALCINSKAYA等[15]在2009年提出并验证了适用于儿童的诊断标准，共有5项标准，满足其中的2条即可诊断。这5项标准是：(1)发热，腋下温度大于38 ℃，持续6～72 h，发作3次及以上；(2)腹痛，持续6～72 h，发作3次及以上；(3)咽痛，持续6～72 h，发作3次及以上；(4)关节炎症，持续6～72 h，发作3次以上；(5)FMF家族史。本患儿符合第1、5条，因此诊断为FMF。

除了根据临床诊断，基因学检测也是FMF诊断的重要依据，MEFV作为FMF的致病基因已被广泛研究。中国FMF的患病率未见报道，但是已经报道过25例临床病例，其中17例儿童，8例成人(其中2例外国人)，没有明显的性别差异[3,5,16-21]。目前，在自身炎症性疾病基因数据库中已经收录了333个MEFV基因的相关变异。本病例中的c.442G>C(p.E148Q)变异，是5种最常见的变异之一，但是由于其人群频率过高，且外显率偏低的问题，和FMF之间的关系颇有争论。在日本的一项调查中，p.E148Q虽然在正常人中的比例为24.8%，但是在FMF患者中的比例高达39.1%，因此p.E148Q仍然被认为是和FMF相关的变异[11]。目前国内报道过的25例患者中，有基因检测结果的21例，其中15例患者含有p.E148Q的变异，即患者基因组中携带p.E148Q的变异的概率是72%。韩丽芳等[22]在2006年，对57例中国人的DNA样本进行了检测，发现p.E148Q的变异率最高，达到45%，这个数据虽然可能包括了FMF患者，但是仍明显低于75%这个比例，因此p.E148Q在中国人群中，应该被认为是和FMF相关的变异，这和c.442G>C在HGMD数据库中的分类(DP)是一致的。

FMF患者有不少是复合杂合变异，有的患者甚至含有4种变异[11]。本例患儿也为MEFV基因复合杂合变异，除p.E148Q外，还有一内含子c.1588-69G>A变异，内含子变异不会直接影响氨基酸序列，而是通过影响RNA剪接等过程，最终影响了编码蛋白的序列或结构，从而导致了疾病的发生。该变异已经被收录于Infevers数据库中，但是该位点在非阿拉伯人群中属首次报道[9]。c.1588-69G>A在HGMD数据库中的分类为DM，本例患儿的临床表现符合FMF，且携带该突变，因此认为该突变的分类应为DM。

MEFV编码的蛋白是Pyrin，其能感知各种细菌毒素对宿主细胞Rho GTPases的修饰和失活，进而形成一个新的炎症小体复合物，并激活半胱天冬酶，在抗细菌天然免疫中发挥重要作用[23]。当MEFV基因发生突变，Pyrin会在结构或序列上发生改变，其正常生理功能发生变化，不能对外界信号进行感应或者对外界信号出现过度反应，进而导致相应的疾病。FMF患者体内的Pyrin就是对外界信号发生了过度或者错误反应，出现了自身免疫性疾病。秋水仙碱和其他多个微管蛋白药物均能特异性抑制Pyrin炎症小体，这些微管药物并不能抑制细菌毒素诱导Pyrin去磷酸化及其与14-3-3蛋白的解离，而是通过阻断Pyrin招募下游接头蛋白发挥抑制性作用[24]。这为临床用药提供了理论依据。

欧洲风湿病防治联合会(EULAR)提出的FMF 管理指南建议，确诊FMF后需尽早使用秋水仙碱治疗[25]。起始剂量推荐5岁以下儿童的服用剂量为小于或等于0.5 mg/d，5～10岁儿童为0.5～1.0 mg/d，10岁以上儿童和成人为1.0～1.5 mg/d，如果药片剂量为每片0.6 mg，上述剂量依次变为小于或等于0.6、0.6～1.2、1.2～1.8 mg/d。如果患者在诊断前就已经有并发症出现(如淀粉样变性等)或病情较重，应加大起始剂量。本例患儿的症状较轻，且为本科首例因周期性发热应用秋水仙碱的患儿，因此起始剂量较小(0.5 mg/d，考虑体质量后为0.01 mg·kg-1·d-1)。治疗1个月后门诊复诊，患儿体温好转，但仍有发热出现，红细胞沉降率下降不明显，且患儿无皮疹、肝肾功能异常等药物不良反应，因此加大剂量治疗(1 mg/d，考虑体质量后为0.02 mg·kg-1·d-1)，发热不再出现，红细胞沉降率逐渐将至正常。

EULAR的FMF 管理指南同时提出，应每6个月对患者的治疗效果，不良反应和用药依从性检测1次。身体或情绪压力较大时会触发FMF的发作，此时相应提高秋水仙碱的剂量。如果FMF患者伴有慢性关节炎，应辅以其他药物进行治疗，如白细胞介素-1拮抗剂等生物制剂、关节内类固醇注射和抗风湿病药物。秋水仙碱的不良反应主要是对肝肾损伤，应引起足够的重视并进行预防。定期检查肝酶，如果肝酶升高到正常上限值的两倍以上，应减少秋水仙碱剂量并进一步检查原因。对肾功能不全者，秋水仙碱的不良反应的风险很高，应定期检查肌酸磷酸激酶水平，并相应调整秋水仙碱剂量。患者在受精、怀孕及哺乳期时，不用停止秋水仙碱治疗。如果患者病情平稳持续5年以上，且急性期蛋白没有升高，可以考虑降低秋水仙碱剂量，但是仍需定期检查，及时干预[25]。

综上所述，临床医生在见到反复性发热的患者时，应在排除感染和肿瘤等因素后，结合FMF的诊断标准并进行基因检测，以确诊该病。本研究通过基因检测发现FMF患儿MEFV基因发生c.442G>C(p.E148Q)和c.1588-69G>A复合杂合变异，该内含子变异在之前并未在非阿拉伯人群中报道过。确诊后，需尽早使用秋水仙碱治疗，并及时随访患者情况，调整秋水仙碱用量。