利拉鲁肽对脓毒症诱导急性呼吸窘迫综合征小鼠的保护作用研究

周 锋,李志锋,王志力,靳 风,张 颖△

(武汉大学中南医院：1.内分泌科;2.重症医学科，武汉 430071)

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一种常见的临床危重症，它可以由多种原因，如脓毒症、严重创伤、急性胰腺炎等引起。脓毒症是引起急性肺损伤的最常见原因。脂多糖被认为是引起ARDS的主要原因[1]。脂多糖通过激活中性粒细胞及巨噬细胞等炎症细胞，如释放白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-18(IL-18)等。这些炎症介质可以加重机体的炎性反应，严重影响机体的肺换气功能，导致低氧血症。而IL-1β及IL-18的成熟及释放主要受炎症小体的调节[2]。NLRP3炎症小体在ARDS的发病机制中扮演重要角色[3]。胰高糖素样肽-1(GLP-1) 是肠道L细胞分泌的一种肽类激素，是体内调节血糖的重要激素。研究发现GLP-1不仅对机体血糖稳定有调节作用，还具有抗炎作用[4-5]。利拉鲁肽是GLP-1类似物，被广泛用于肥胖及2型糖尿病的治疗。VIBY等[6]研究发现，利拉鲁肽可以抑制慢性阻塞性肺疾病的炎性反应，缓解慢性阻塞性肺疾病的急性发作。而利拉鲁肽对急性肺损伤是否具有保护作用，目前鲜有报道。本研究主要观察利拉鲁肽对脂多糖诱导的脓毒症小鼠ARDS的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及模型制备 将6～8周健康雄性Balb/c 30只(湖北省疾病预防控制中心提供)，分为3组，每组10只：对照组、ARDS组、利拉鲁肽干预组。对照组及ARDS组小鼠先给予无菌生理盐水皮下注射，利拉鲁肽干预组给予利拉鲁肽200 μg/kg皮下注射。利拉鲁肽皮下注射6 h后，对照组小鼠腹腔注射无菌生理盐水，ARDS组及利拉鲁肽干预组小鼠腹腔注射10 mg/kg脂多糖[7]。脂多糖注射4 h后，取材做以下指标检测。

1.2试剂 利拉鲁肽(丹麦Novo Nordisk公司)，脂多糖(Sigma公司)，NLRP3抗体(R&D公司)，ASC及caspase-1抗体(Protein Tech公司)；IL-1β及IL-18酶联免疫试剂盒(武汉依莱瑞特生物科技公司)等。

1.3方法

1.3.1病理学检测 处死小鼠后，用10%甲醛溶液固定小鼠左上肺组织，石蜡包埋后用苏木精-伊红(HE)染色。根据Murakami评分方法[8]，按照0～4级(0级，无；1级，轻；2级，中；3级，强；4级，重)评分对肺损伤程度进行病理评分。

1.3.2肺组织湿/干重(W/D)比值 取左下肺，用滤纸吸干肺表面水分，称取各组小鼠肺组织湿重后，将肺组织放入烤箱(80 ℃)，48 h，称干重，计算W/D比值。

1.3.3支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白及炎症因子水平 采用BCA法检测BALF的蛋白水平，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测BALF中IL-1β及IL-18水平。

1.3.4肺组织NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表达 用RT聚合酶链反应(PCR)法检测NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表达。用Trizol法提取总RNA，光谱扫描多功能仪测定RNA的纯度和浓度。RNA样本OD260/OD280值在1.8～2.0范围内。反转录合成cDNA:取2 μg RNA，将RNA反转录成cDNA。 RT-PCR扩增cDNA：NLRP3上游引物5′-CTC GCA TTG GTT CTG AGC TC -3′；下游引物5′-AGT AAG GCC GGA ATT CAC CA-3′；ASC上游引物5′-CTA TCT GGA GTC GTA TGG CTT GG-3′；下游引物5′-ATG AGT GCT TGC CTG TGC TGG TC-3′；caspase-1上游引物5′-GGC AAG CCA AAT CTT TAT CAC-3′；下游引物5′-GCC ATC TTC TTT GTT CTG TTC-3′；β-actin上游引物5′-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′；下游引物5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′。反应体系为20 μL,扩增条件：95 ℃热启动5 min后；95 ℃ 30 s，58 ℃退火延伸30 s，共40循环。每份样本重复检测3次，取平均Ct值，用相对定量法(2-△△Ct)计算各组小鼠目的基因表达。

A：对照组；B：ARDS组；C：利拉鲁肽干预组

图1 各组肺组织病理学改变

2 结 果

2.1肺组织病理学改变 对照组小鼠肺组织病理结构正常，腹腔注射LPS 4 h后，ARDS组小鼠肺组织结构出现明显破坏，肺内出现较多炎症细胞浸润，并伴有出血、水肿及透明膜形成。利拉鲁肽干预小鼠上述病理学改变明显减轻(图1)。

2.2肺组织W/D比值 同对照组比较，ARDS组小鼠肺W/D明显升高(P<0.05)，利拉鲁肽干预组小鼠肺W/D较ARDS组小鼠明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠肺组织W/D比值

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与ARDS组比较

表2 各组小鼠BALF中蛋白、IL-1β及IL-18水平

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与ARDS组比较

2.3BAFL中的蛋白、IL-1β及IL-18水平 同对照组比较，ARDS组小鼠BALF中蛋白、IL-1β及IL-18水平明显升高(P<0.01)，利拉鲁肽干预组小鼠BALF中蛋白、IL-1β及IL-18水平明显降低(P<0.05)，见表2。

2.4肺组织NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA表达 同对照组比较，ARDS组小鼠肺组织中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表达明显升高，利拉鲁肽干预组小鼠肺组织中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表达较ARDS组明显降低(P<0.05)，见表3。

表3 各组小鼠NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表达比较

a：P<0.01，与对照组比较；b：P<0.05，与ARDS组比较

3 讨 论

ARDS的特征主要表现为肺间质水肿、炎症细胞浸润、肺上皮通透性增加及蛋白向肺泡腔中渗透，最终导致严重的肺换气功能障碍[9]。本研究显示，利拉鲁肽干预能改善ARDS小鼠肺组织病理学改变，降低ARDS小鼠肺W/D及蛋白渗出，说明利拉鲁肽早期干预可以改善脓毒症诱导的小鼠肺组织损伤。

炎症细胞因子介导的炎性反应在ARDS的发病机制中扮演重要角色[10]。IL-1β是引起肺内炎性反应的重要炎症介质，ARDS患者肺泡液内IL-1β水平明显增高[11]。过量的IL-1β损伤血管内皮细胞的完整性，加重肺泡上皮细胞的通透性，引起肺水肿[12]。研究发现，IL-18水平升高可以增加急性肺损伤患者的病死率[13]。本研究表明，脓毒症诱导的ARDS小鼠BALF中炎症介质IL-1β及IL-18水平显著升高，利拉鲁肽预处理可以显著降低BALF中IL-1β及IL-18水平，提示利拉鲁肽干预可能是通过抑制IL-1β及IL-18来减轻脓毒症诱导的小鼠ARDS。

NLRP3炎症小体由NLRP3、ASC及caspase-1前体组成，内源性或外源性的刺激引起NLRP3炎症小体活化[14]。NLRP3炎症小体的活化调节着炎症因子IL-1β及IL-18的成熟及分泌[15]。在NLRP3敲除的小鼠中，脂多糖诱导的急性肺损伤改变明显减轻[16]。NLRP3基因敲除可以降低capase-1的活化及体内IL-1β的水平[17]。在IL-18基因敲除小鼠，急性肺损伤也明显好转[3]。本实验中，LPS注射后4 h，ARDS组小鼠肺组织NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表达显著升高，给予利拉鲁肽后ARDS小鼠上述指标mRNA表达明显降低，说明利拉鲁肽可能是通过 抑制NLRP3炎症小体活化，进而抑制促炎细胞因子IL-1β及IL-18的合成及释放，从而改善脓毒症诱导的小鼠肺损伤。

综上所述，利拉鲁肽作为一种常用的糖尿病治疗药物，其不良反应少、安全性高。本研究采用利拉鲁肽对ARDS小鼠进行干预，小鼠肺组织损伤明显改善，说明利拉鲁肽通过抑制炎症小体的活化，拮抗炎性反应对ARDS小鼠发挥保护作用。