丹参酮ⅡA通过抑制STAT3活化调控胃癌细胞增殖和凋亡的研究

张拥军，彭伯坚，曹天生，卢秀珊，郭曙光

(1.广东省广州市花都区人民医院消化内科 510800；2.广东省广州市花都区人民医院普外科 510800；3.中山大学附属第三医院体检科，广州 510630)

胃癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一[1-2]。据不完全统计,每年新发病例约有100万例[3-4]。尽管目前胃癌治疗取得了一定的进展，但晚期胃癌患者的总体疗效不太理想，5年生存率仅为5%～20%[5-6]。近年来，众多的研究表明传统中草药具有显著的抗肿瘤活性[7-9]。丹参酮ⅡA(TanⅡA)是天然植物丹参的主要活性成分，前期的研究已发现它具有多种药理活性，比如缓解心绞痛，有效改善血流动力学等[10-12]。近年来，丹参酮ⅡA在乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌和前列腺癌中的抗肿瘤活性也广受研究者青睐[13-14]。虽然有研究表明TanⅡA能抑制胃癌细胞生长，但其潜在的分子机制尚不清楚[15-16]。

信号转导和转录激活因子3(STAT3)是信号转导因子STAT家族的成员之一[17]。它广泛参与调节了一系列生物过程,如细胞增殖、肿瘤发生、血管生成和表皮细胞向间充质细胞转化等[18]。磷酸化STAT3分子上的2个磷酸化位点酪氨酸705(Tyr705)和丝氨酸727(Ser727)对于STAT3组成性激活以及肿瘤的发生、发展发挥着关键作用[19-21]。有研究表明STAT3 的构成性激活可以促进胃癌的进一步恶化和发展[22-23]。因此，以STAT3为靶点，发掘新的能抑制STAT3组成性激活的化合物对于治疗人类胃癌具有重要的临床意义。本研究中采用人胃癌细胞株，并给予TanⅡA处理，探讨TanⅡA对胃癌细胞增殖的影响，并明确其作用机制是否与抑制STAT3活化有关。

1 材料与方法

1.1细胞培养及试剂 人胃癌细胞株(SNU-638、MKN1和AGS)购自国家细胞资源中心(中国科学院，上海)。SNU-638和MKN1细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，AGS细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，并置于含5%CO2的恒温培养箱。TanⅡA购自Sigma-Aldrich公司。cleaved caspase-3、Bcl和Bax抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，p-STAT3和STAT3抗体购自Cell Signaling Technology公司。FLAG-STAT3和phRL-TK质粒购自生工公司。

1.2四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖 将细胞以1×104个细胞/孔接种于 96 孔培养板中过夜。随后给予不同浓度的TanⅡA处理不同时间后，每孔加入20 μL MTT染料继续孵育2 h。小心移除培养基并加入溶解/终止溶液。使用酶标仪在570 nm处检测各孔吸光度并计算细胞存活率。

1.3细胞凋亡检测 当不同浓度的TanⅡA处理细胞后，收集细胞至离心管中，离心弃培养液，用PBS洗涤。随后使用Annexin V和PI双染色，应用流式细胞仪分析结果。根据比例计算不同药物浓度对细胞凋亡的影响。

1.4Western blot 当用不同浓度的TanⅡA处理细胞后，加入裂解缓冲液裂解细胞并收集、提取总蛋白进行定量。随后采用SDS-PAGE分离，PVDF膜电转，脱脂牛奶(5 %)封闭1 h,分别加入一抗孵育4 ℃过夜。次日加入TBST缓冲液洗膜3次后加入辣根过氧化酶标记二抗，室温摇床孵育1 h后用TBST缓冲液洗膜3次。最后采用ECL法显影,并进行定量分析。

1.5细胞转染和STAT3转录活性 根据Lipofectamine 2000使用说明书，将 FLAG-STAT3质粒和对照质粒phRL-TK分别瞬时转染细胞后，并给予指定浓度的TanⅡA处理。随后用双荧光素酶报告基因测定系统测定STAT3的转录活性。

2 结 果

2.1TanⅡA抑制人胃癌细胞增殖 MTT实验结果显示TanⅡA能以时间和剂量依赖的方式有效抑制SNU-638细胞增殖(图1A和1B)。10 μg/ mL Tan ⅡA表现出最强抗肿瘤活性，因此被用于后续研究。与此同时，当给予不同浓度TanⅡA处理人胃癌MKN1和AGS细胞之后， TanⅡA也能明显抑制细胞增殖(图1C和1D)，但以SNU-638细胞活性最佳，因此SNU-638细胞被选择用于进一步研究。

2.2TanⅡA诱导人胃癌细胞凋亡 当Annexin-V/PI 双染色标记TanⅡA处理SNU-638细胞后，使用流式细胞仪检测TanⅡA对胃癌细胞凋亡的影响。图2A，2B显示，TanⅡA处理之后能明显增加凋亡细胞比例，百分比由7.77%±2.24%(对照组)增加到TanⅡA处理组13.80%±4.06%(2.5 μg/mL)，22.70%±4.25%(5 μg/mL)和32.87%±6.80%(10 μg/mL)。图2C显示TanⅡA处理之后能诱导Bax和cleaved caspase-3的蛋白表达，并抑制Bcl蛋白水平。

A:TanⅡA对3种胃癌细胞增殖的时效、量效关系；B:TanⅡA对SUN-638细胞增殖的影响；C：TanⅡA对MKN1细胞增殖的影响；D:TanⅡA对AGS细胞增殖的影响

图1 TanⅡA对人胃癌细胞增殖的影响

A:Annexin V、PI双染色细胞凋亡图；B:相对细胞凋亡率；C：Western blot蛋白条带及相对蛋白表达

图2 TanⅡA对胃癌细胞凋亡的影响

A:TanⅡA对STAT3磷酸化的影响；B:TanⅡA对STAT3转录活性的影响；C:过表达STAT3对细胞增殖的影响；D:过表达STAT3对细胞凋亡的影响

图3 TanⅡA对STAT3信号通路的影响

2.3STAT3在TanⅡA抑制人胃癌细胞增殖中的作用 如图3A所示， TanⅡA(5,10 μg/mL)处理SNU-638细胞能有效抑制STAT3中Tyr705位点的磷酸化水平(约54%和77%)。为了进一步证实STAT3信号通路是否参与了TanⅡA抗胃癌细胞增殖过程，本研究采用了SNU-638细胞与p-STAT-LUC质粒共转染。双荧光素报告实验显示TanⅡA(5,10 μg/ mL)处理后能有效降低STAT3的活性(图3B)。STAT3过表达后能显著减少TanⅡA抑制细胞增殖和诱导凋亡的比例(图3C和D)。

3 讨 论

本研究发现了中药丹参分离得到的生物活性组分TanⅡA能有效抑制人胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，具体机制是由于 TanⅡA 作用于STAT3的磷酸化Tyr705位点从而抑制STAT3磷酸化水平，STAT3质粒共转染实验进一步证实了推断。本研究结果表明TanⅡA能有效抑制STAT3活化过程，从而发挥抗胃癌作用。

胃癌是常见恶性肿瘤,其病死率居全球第三[24]。近年来尽管在胃癌的诊断和治疗方面取得了较大进展，但胃癌患者的总体预后仍然较差[25-26]。目前的治疗方式能够在一定程度上控制病情,延长患者生存期,但严重的毒副作用不仅会影响复发患者的生活质量,甚至还会危及患者的生命[27]。因此，研发用于胃癌治疗的新药物具有重要的临床意义。

TanⅡA是从丹参根茎提取的活性成分，大量证据表明TanⅡA对多种癌细胞的生长具有抑制作用[28]。本研究发现TanⅡA处理之后可明显诱导细胞凋亡，增加Bax和cleaved caspase-3的蛋白表达并下调Bcl蛋白水平。前期研究报道STAT3信号通路的组成性活化被认为是癌症发生、发展和进展的重要因素[20,29]。本研究发现TanⅡA处理后可明显抑制体内STAT3磷酸化过程，而且表现出剂量依赖性。当细胞中过表达STAT3时，TanⅡA对细胞增殖的抑制比例以及诱导SNU-638细胞凋亡显著减少。本研究阐明了STAT3在TanⅡA调控胃癌细胞增殖和凋亡过程中的作用。但是，TanⅡA在体内是否发挥抗胃癌活性，TanⅡA如何影响体内胃癌肿瘤组织中凋亡相关蛋白表达，以及STAT3如何参与调控值得进一步探讨。不仅如此，TanⅡA通过其他机制起作用的可能性不能排除，值得深入研究。而本研究仍存在一些局限，比如应该同时纳入正常的胃细胞进行比较分析，从而进一步阐述TanⅡA的作用是癌症特异性的。综上所述，本研究认为TanⅡA可能通过下调STAT3活化水平从而发挥抗胃癌活性。