北京鸭群体遗传多样性及遗传资源分析

2019-05-27杨宇泽侯卓成

中国畜牧杂志 2019年5期

杨宇泽，侯卓成，常卓，张权

（1.北京市畜牧总站，北京 100101；2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；3.广东海洋大学农学院，广东湛江 524088）

地方鸭品种的遗传多样性十分丰富，是品种改良的遗传基础和原始素材。其中，北京鸭是我国优良的地方品种，是世界水禽业中优势最大的品种之一，具有生长速度快、肉质细嫩、繁殖力高、适应性强、适合圈养等优点[1]，成为其保种的重要原因。因此，研究北京鸭群体遗传结构可为其保种及定向选育或遗传改良提供重要依据。

微卫星标记具有DNA 多态性杂合程度高、共显性遗传、易于鉴定、检测重复性好等特点，在生物体整个基因组中广泛分布[2]。微卫星标记遗传多态性能充分反映品种进化历史[3]，广泛应用于畜禽品种的遗传多样性研究。任康等[4]采用微卫星标记研究了北京鸭群体遗传多样性。刘宏祥等[5]利用微卫星标记分析表明，马踏湖鸭、金定鸭和巢湖鸭3 个鸭群体存在明显的遗传差异。赵东伟等[6]利用微卫星标记分析表明，徐海鸡3个世代群体的遗传多样性丰富并保持了较好的遗传稳定性。于波[7]利用微卫星标记分析得出，北京鸭微卫星位点多态性与开产日龄、开产体重和300 日龄产蛋量等产蛋性状相关。由此可见，利用微卫星标记技术在鸡、鸭等家禽品种群体遗传多样性及其与生产性能的相关性研究中取得了许多有价值的研究成果。本研究选择遗传多样性较为丰富的11 对微卫星位点来分析北京鸭保种群体3 个世代的遗传多样性，旨在为北京鸭保种群体的遗传资源保护及进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料本实验动物由北京鸭保种场提供，分别采集F0、F1和F2世代北京鸭血样120、100 只和100 只。3 个世代群体公母比例为1∶1。翅静脉采集1 mL 血液，置于含有0.1 mL EDTA 抗凝剂的离心管中，混匀后置于-20℃低温保存。

1.2 微卫星引物采用联合国粮食与农业组织（FAO）和国际动物遗传学会（ISAG）推荐的11 对微卫星标记和引物序列用于北京鸭遗传多样性分析（表1）。为实现微卫星多态性荧光半自动检测，对11 对微卫星上游引物进行HEX 和FAM 荧光修饰，ROX 为分子量内标。微卫星座位11 对荧光标记引物由北京阅微基因技术有限公司合成。

1.3 鸭血液DNA 提取与检测按照天根血液基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型，货号：DP318-03）的提取步骤提取。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 样本。

1.4 荧光标记多重PCR 扩增根据荧光标记引物的颜色、扩增产物及退火温度，对引物选择组合，每组引物数量为2～4 对，对北京鸭DNA 样本进行PCR 扩增。PCR 反应体系（15 μL）：10×BufferI 1.5 μL，2.5 mmol/L d NTP 1.2 μL，F-Primer（5 μmol/L）0.8 μL，R-Primer（5 μmol/L）0.8 μL，TaKaRa HSTaq 0.1 μL，DNA 模板 1.2 μL，ddH2O 补齐至15 μL。PCR 反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，50～60℃（表1）退火30 s，72℃延伸30 s，共30 个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.5 微卫星基因扫描选取1 μL PCR 产物、8.5 μL 甲酰胺和0.5 μL ROX-500 分子量内标，3 000 r/min 离心1 min，95℃变性5 min，置于冰上10 min，离心后用ABI 3730XL DNA analyzer 进行基因扫描使用Genotyper3.7 软件分析基因分型数据，标定DNA 扩增片段大小和基因型。

1.6 统计分析根据PopGen32 软件对数据进行统计分析[4]。计算等位基因/ 有效等位基因数量（Na/Ne）、等位基因频率（allele frequency）、群体期望杂合度（He）、观察杂合度（Ho）、Hardy-Weinberg 平衡检验、F 统计量，picale 软件计算多态信息含量（PIC）。采用SPSS 19.0进行单因素方差分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 血液DNA 检测结果提取的DNA 样品检测结果（图1）显示，DNA 纯度和亮度都比较高，无拖尾现象，可以满足后续试验要求。

图1 部分北京鸭血液DNA 样品检测结果

2.2 PCR 产物检测 PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测结果满足后续实验条件（图2）。PCR 产物在ABI 3730XL DNA analyzer 测序后基因分型如图3 所示。各峰图表示北京鸭微卫星位点等位基因的大小及基因型。

2.3 北京鸭群体的遗传多态性表2 显示，北京鸭群体11 个微卫星座位Ne 的变化范围为1.129 3～4.806 0，其中微卫星座位CMO12 的Ne 最多（4.806 0），微卫星座位SMO13 最少（1.129 3）。F0、F1和F2世代平均Ne分别为2.249 3、1.927 8 和2.177 4，3 个世代间的Na/Ne 差异不显著。北京鸭群体11 个微卫星座位PIC 较高，平均值为0.508 0。其中，微卫星位点CMO12PIC 最高，达到0.758 7。北京鸭群体3 个世代的PIC 平均值以F0世代最高（0.441 3），F1世代最低（0.303 8），3 个世代间差异不显著。

表1 微卫星座位相关信息

图2 部分微卫星位点PCR 结果

图3 部分微卫星位点STR 分型峰图

由表3 可知，北京鸭群体3 个世代的遗传杂合度为0.432 3，微卫星座位CMO11 的遗传杂合度最高（0.700 9），微卫星座位SMO13 最低（0.107 3）。北京鸭群体3 个世代的平均Ho 以F1世代最低（0.324 5），F2世代最高（0.444 6），3 个世代间差异不显著；北京鸭群体3个世代的平均He 以F1世代最低（0.363 3），F0世代最高（0.487 7），3 个世代间差异不显著。

2.4 北京鸭群体遗传结构检验（Hardy-Weinberg 平衡检验）由表4 可见，北京鸭群体多数微卫星座位偏离Hardy-Weinberg 平衡检验（P＜0.05），只有微卫星座位APL78 处于平衡状态（P＞0.05）。F0世代微卫星座位APL36、APL78、APH10 和SMO11 等4 个位点处于平衡状态（P＞0.05）；F1世代微卫星座位APH01、CMO11、APH78、APH10 和SMO13 等5 个位点处于平衡状态（P＞0.05）；F2世代微卫星座位APH01、APL36、SMO6、SMO7、APL78 等5 个位点处于平衡状态（P＞0.05）。北京鸭F0、F1和F2群体在11 个微卫星位点中均有50%以上的位点偏离Hardy-Weinberg 遗传平衡，说明在北京鸭3 个世代群体内存在较大的遗传变异。

表2 北京鸭品种微卫星座位等位基因数量与多态信息含量

表3 北京鸭品种微卫星座位的杂合度

表4 北京鸭群体Hardy-Weinberg 平衡检验

2.5 北京鸭群体3 个世代间的遗传分化（F 统计量检验）由表5 可见，北京鸭群体3 个世代的群体内近交系数（Fis）平均值为0.086 9，总体近交系数（Fit）平均值为0.279 7，群体间基因分化系数（Fst）平均值为0.211 1。微卫星座位的基因流（Nm）变化范围从微卫星座位APH10 的0.250 2 到微卫星座位APL78 的24.984 2，平均值为0.934 1。

3 讨论

家禽微卫星标记位点等位基因数一般为2～20 个，大部分为2～7 个。PIC 和遗传杂合度是衡量微卫星基因座变异程度高低的指标，当PIC＞0.5 时，该基因座为高度多态性基因；当0.25＜PIC＜0.5 时，该基因座为中度多态，基因座能提供较为合理的信息；当PIC＜0.25，为低度多态性基因座，基因座可提供的信息较差；遗传杂合度＞0.5 时，表明该群体没有受到高强度的选择，拥有丰富的遗传多样性；若遗传杂合度＜0.5 时，表明该群体遗传多样性较低[3,8]。本实验结果表明，11 个微卫星位点在北京鸭群体F0世代平均Na/Ne 数量为4.6/2.249 4 个，F1世代为3.5/1.927 8 个，F2世代为4.5/2.177 4 个，每个微卫星座位检测到Na 为2～7 个，平均Na/Ne 数量为4.9/2.812 6 个，检测到的Na 均高于Ne，说明等位基因分布不均匀，可能是由近交导致。北京鸭群体F0世代11个微卫星座位测得的平均He 和平均PIC 分别为0.487 7、0.441 3；F1世代分别为0.363 3 和0.308 8；F2世代分别为0.415 0 和0.454 2，说明北京鸭群体具有较为丰富的遗传多样性。任康等[4]利用23 个微卫星位点对北京鸭群体进行分析得出群体平均Na/Ne、PIC 和He 分别为8.5/3、0.525 和0.551。张扬等[9]利用12 个微卫星位点对凤头白鸭和连城白鸭群体分析得出，凤头白鸭群体平均Na/Ne、He 和PIC 分别为5.42/2.86、0.54 和0.50，连城白鸭群体平均Na/Ne、He 和PIC 分别为3.83/2.24、0.48 和0.35。赵丽丽等[10]利用17 个微卫星位点对金定鸭群体分析得出群体平均He 和PIC 分别为0.581 6和0.596 7。龚道清等[11]利用9 个微卫星位点对高邮鸭群体分析得出群体平均Na、遗传杂合度和PIC 分别为4.7、0.737 5 和0.670 7。微卫星标记数量[12]、样本量和性比影响微卫星分析中的群体遗传多样性指标，He受样本量变动的影响较小，可作为度量群体遗传多样性的一个最适参数[13]。本研究中，北京鸭群体3 个世代平均He 分别为0.487 7、0.363 3 和0.454 2，低于其他地方品种鸭，这可能与微卫星标记数量、地方品种鸭保种及选育程度有关。北京鸭群体F1世代的平均He 和平均PIC 低于F0和F2世代，但3 个世代鸭群的Na/Ne、He、PIC 差异均不显著，F1世代可能是群体基因频率的随机遗传漂变导致遗传多样性降低。

表5 北京鸭群体3 个世代遗传分化程度统计量

群体遗传结构的稳定性是通过Hardy-Weinberg 平衡定律衡量。Hardy-Weinberg 平衡定律主要是在一个随机交配的大群体中，除去选择、突变和迁移等因素的影响，存在于常染色体上的等位基因频率和基因型频率随世代的延续而应保持不变。本研究对所检测的北京鸭群体3 个世代进行Hardy-Weinberg 平衡检测，结果发现在11 个微卫星座位上，F0、F1和F2世代分别有4、5、5 个微卫星座位处于平衡状态，其余位点显著偏离Hardy-Weinberg 平衡，这种偏离可能是这些位点与北京鸭重要经济性状的基因之间连锁较紧密。

本研究利用F-统计量来测量群体间遗传分化程度，主要包括Fis、Fit 和Fst。Fis 和Fit 分别表示个体相对于它所在的亚群体和总群体的近交系数。Fis=0 表示配对方式为随机配对；Fis＞0 表示近亲交配；Fis＜0 表示异配生殖。本研究结果表明，北京鸭群体11 个微卫星座位上的Fis 为0.086 9，Fis 为0.279 7，说明北京鸭群体在每个世代内的近交程度较低，但3 个世代间可能有近交现象。Fis 数值正负反映群体内Ho 和He 之间的平衡关系，其值大小表明群体中杂合子缺失或过剩程度[9]。本研究中，北京鸭群体微卫星位点APL36、APL78 和CMO11 3 个位点的Fis＜0，表明这些位点中的杂合子过剩，优势等位基因频率降低。Fis 是反映各亚群体内平均遗传杂合度与总群体遗传杂合度的差异程度，其值越大，表明各亚群体间遗传分化越明显[14]。本研究中，11 个微卫星基因座Fis 平均值为0.211 1，表明北京鸭群体遗传分化程度较低，群体中21.11%的遗传变异由群体间的遗传变异引起，78.89% 的遗传变异由群体内的个体差异引起。Nm 是阻止种群遗传分化的重要进化因子[15]，也是影响遗传结构的重要因素。当N m＜1 时，遗传漂变是区分种群遗传结构的主导因素[16]。本研究结果表明，检测的北京鸭群体微卫星座位APH01、APH10、APL36和SMO7 的基因流均小于1，北京鸭群体间平均基因流为0.934 1，说明北京鸭群体可能有遗传漂变的因素导致群体遗传分化。