双歧杆菌联合包裹液态氟碳阳离子脂质纳米粒增加HIFU消融效果：实验研究

2019-05-27邹建中蒋冰蕾

中国介入影像与治疗学 2019年5期

高悬，邹建中*，蒋冰蕾，徐蝶，罗勇，

(1.重庆医科大学生物医学工程学院省部共建国家重点实验室培育基地—重庆市超声医学工程重点实验室重庆市生物医学工程学重点实验室重庆微无创医学协同创新中心，重庆 400016；2.重庆医科大学超声影像学研究所，重庆 400010)

HIFU已广泛用于治疗实体肿瘤。由于超声波在传播过程中能量衰减较大，当肿瘤体积较大或其位置深在时，HIFU疗效会受到较大影响[1]。在靶区引入碘油、微泡等物质，可通过改变组织的声环境来增强HIFU消融效果；但这些物质的靶向性不强，在肿瘤及其周围组织器官内均存在，辐照时易导致声通道组织损伤[2-5]。近年来，研发体内滞留时间长且靶向性强的HIFU增效剂逐渐受到关注。本研究探讨HIFU生物靶向增效的可行性，以双歧杆菌[5-7]作为载体，联合包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒，观察其增强HIFU消融的效果。

1 材料与方法

1.1 双歧杆菌培养及镜下观察将长双歧杆菌ATCC15707(重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系提供)于37℃、厌氧条件下，在MRS培养基中培养24 h，4℃条件下以1 000 r/min离心10 min。将细菌浓度调整至6×107/ml备用。革兰氏染色后于光学显微镜下观察双歧杆菌形态，并采用Malvern ZEN3600型分析仪测量其表面电位。

1.2 包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒制备及镜下观察将二棕榈酰基卵磷脂(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine， DPPC；Avanti公司)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基{1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-PEG2000-Amine；Avanti公司}、胆固醇盐酸盐(DC-cholesterol hydrochloride， DC-CHOL；Avanti公司)按5∶2∶2的比例溶于氯仿中，旋转蒸发去除有机溶剂成膜，加入双蒸水洗脱后，滴加100 μl液态氟碳全氟己烷(perfluorohexanes， PFH；沸点56℃)，均质乳化后获得包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒，4℃保存备用。于光学显微镜下观察阳离子脂质纳米粒形态，并采用Malvern ZEN3600型分析仪测量其粒径及表面电位。

1.3 双歧杆菌与阳离子脂质纳米粒体外连接将100 μl绿色荧光染料异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)标记的双歧杆菌(浓度1×106/ml)加入300 μl红色荧光染料细胞膜红色荧光探针(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate， DiI)标记的阳离子脂质纳米粒(浓度1 mg/ml)中，孵育10 min后，稀释200倍备用。采用Nikon A1R型激光共聚焦显微镜观察双歧杆菌与阳离子脂质纳米粒的连接情况，以CytoFLEX PN B49007AD型流式细胞仪检测连接率。

1.4 建立荷瘤鼠模型选取4周龄雌性BALB/c裸鼠48只(重庆医科大学动物实验中心提供，动物实验审查批准号：CQLA-2016-406)，体质量18～24 g，平均(21.14±2.04)g。将0.2 ml培养至对数生长期的浓度调为4×106/ml的人乳腺癌MDA-MB231细胞(重庆医科大学超声影像学研究所提供)接种于每只裸鼠左侧臀部皮下，之后常规饲养，待瘤体最大径达0.8 cm时用于后续实验。

1.5 HIFU辐照

1.5.1 分组处理选取48只荷瘤鼠随机均分为A组[磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)组]、B组(双歧杆菌组)、C组(阳离子脂质纳米粒组)和D组(双歧杆菌+阳离子脂质纳米粒组)，每组12只。首先对A、C组荷瘤鼠经尾静脉注射0.2 ml PBS，B、D组荷瘤鼠经尾静脉注射0.2 ml双歧杆菌(浓度1×106/ml)；而后于首次注射后72 h，对A、B组再注射0.2 ml PBS，C、D组再注射0.2 ml阳离子脂质纳米粒(浓度0.1 mg/ml)。

1.5.2 HIFU辐照及评价采用海扶JC200型聚焦超声肿瘤治疗系统，于第2次注射完成后24 h在超声监控下行HIFU辐照。消融参数：治疗头频率0.94 MHz，焦距145 mm，换能器直径220 mm；辐照方式为点辐照，功率150 W，辐照时间2 s。辐照后即刻，通过声像图观察荷瘤鼠肿瘤组织灰度变化，与辐照前对照，系统自动测得灰度变化值。

1.6 组织学观察 HIFU辐照前1 h，从各组中各随机选取2只处死，完整剥离肿瘤并摘取荷瘤鼠心、肝、脾、肺、肾组织，以4%多聚甲醛固定，革兰氏染色后于光学显微镜下观察肿瘤组织及重要脏器中双歧杆菌的生长情况，验证双歧杆菌的肿瘤靶向性。HIFU辐照后1天，将荷瘤鼠全部处死，完整剥离肿瘤后，沿最大面切开，用2%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride， TTC)染色，肉眼观察其大体组织学情况，并测算各组荷瘤鼠肿瘤组织凝固性坏死体积和HIFU消融能效因子(energy efficiency factor， EEF)。凝固性坏死体积(mm3)=(π/6)×长度(mm)×宽度(mm)×深度(mm)，EEF(J/mm3)=声功率(W)×辐照时间(s)/凝固性坏死体积(mm3)。

1.7 统计学分析采用SPSS 21.0统计分析软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双歧杆菌和阳离子脂质纳米粒的表征双歧杆菌革兰氏染色呈蓝紫色的长棒状(图1A)，表面电位为-29 mV(图1B)。阳离子脂质纳米粒呈球形，分布均匀(图2A)，粒径220～340 nm，平均(280.21±60.20)nm(图2B)，表面电位为25 mV(图2C)。

图1 双歧杆菌表征 A.光学显微镜下观察(革兰染色，×400)； B.表面电位检测图2 包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒表征 A.光学显微镜下观察(×400)； B.粒径检测； C.表面电位检测

2.2 体外连接情况双歧杆菌与阳离子脂质纳米粒体外连接后，激光共聚焦显微镜下可见FITC标记的双歧杆菌表面附着大量被DiI标记的阳离子脂质纳米粒(图3)。流式细胞仪检测其连接率为99.9%(图4)。

2.3 HIFU消融效果

2.3.1 灰度变化值 HIFU辐照后，4组荷瘤鼠肿瘤组织声像图均可见不同程度灰度变化(图5)。各组间灰度变化值差异有统计学意义(F=143.40，P<0.001，表1)，A组

2.3.2 凝固性坏死体积 HIFU辐照后，4组荷瘤鼠肿瘤组织内均可见凝固性坏死，坏死区呈灰白色，而未坏死区切面呈红色(图6)。各组间凝固性坏死体积差异有统计学意义(F=243.20，P<0.001，表1)，A组

表1 各组荷瘤鼠肿瘤组织灰度变化值、EEF及凝固性坏死体积(±s)

组别灰度变化值凝固性坏死体积(mm3)EEF(J/mm3)A组10.44±2.7437.48±7.13816.62±3.65B组18.78±3.5348.91±7.4512.57±2.19C组26.44±3.7173.62±8.588.26±1.04D组43.33±3.94131.60±10.464.59±0.40F值143.40243.2056.33P值<0.001<0.001<0.001

注：A组：PBS组；B组：双歧杆菌组；C组：阳离子脂质纳米粒组；D组：双歧杆菌+阳离子脂质纳米粒组

2.3.3 EEF 各组间EEF差异有统计学意义(F=56.33，P<0.001，表1)，A组>B组>C组>D组，且两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05，表2)。

2.3.4 靶向性 4组荷瘤鼠心、肝、脾、肺、肾组织中均无双歧杆菌生长；A、C组肿瘤组织中无双歧杆菌，B、D组肿瘤组织中可见大量双歧杆菌(图7)。

3 讨论

微泡、羟基磷灰石纳米复合物等现有HIFU增效剂存在靶向性不强的问题，对HIFU消融增效有限；目前仍在不断探索，以提升HIFU消融效率。本研究利用双歧杆菌能够靶向肿瘤乏氧区的特性，将其与具有HIFU增效作用的包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒相结合，克服了传统HIFU增效剂靶向性不强的问题。本研究结果显示，表面带有负电荷的双歧杆菌与阳离子脂质纳米粒在体外可通过静电吸附的方式有效连接，连接率达99.9%。本研究中C组荷瘤鼠HIFU辐照后肿瘤组织灰度变化值及凝固性坏死体积均明显高于A组(P均<0.001)，表明包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒具有增效HIFU的作用，与周洋等[8]研究结果相符；此外，D组灰度变化值及凝固性坏死体积均明显高于C组(P均<0.001)，分析其原因：①双歧杆菌增殖可能改变了肿瘤组织局部声环境，使超声能量沉积增加，进而增强HIFU消融肿瘤效果；②包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒在肿瘤中的滞留量增加，增强了HIFU消融肿瘤的效果。肿瘤组织中阳离子脂质纳米粒滞留量增加的原因可能包括：①双歧杆菌在肿瘤组织中生长72 h后，通过静电吸附作用可连接数量较多阳离子脂质纳米粒；②双歧杆菌在肿瘤组织中增殖，不仅可提高巨噬细胞的吞噬功能，还能通过提高局部一氧化氮水平而增强滞留效应(enhanced permeability and retention effect， EPR)效应和肿瘤血管通透性[9-11]，使阳离子脂质纳米粒“漏入”肿瘤组织中的数量增多。