HPLC法测定黄芩苷化学原料药中主成分的含量及有关物质

毕 彤，董海荣，朱 磊

（1.天津药物研究院药业有限责任公司，天津 300000；2.颈复康药业集团有限公司）

黄芩苷为化学原料药，收载于《国家药品标准·化学药品地方标准上升国家标准》第十册。据文献报道，黄芩苷具有解热[1]、抑菌[2]、抗炎[3]、抗变态反应[4-5]、降血压[6]、抗心律失常[7]、调节血脂[8]、抗动脉粥样硬化[9]等多种药理作用。近年来黄芩苷做为针剂、口服液和固体制剂的原料药，需求量日益增加。黄芩苷原料药的质量决定相关制成品的品质，尤其是黄芩苷和有关物质的含量对成品的疗效可产生重要影响。为此，本研究建立了高效液相色谱法（HPLC）法测定黄芩苷原料药的含量和有关物质的方法，以期为有效控制黄芩苷原料药的质量提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260 Series高效液相色谱仪、配套Chemstation色谱工作站，美国Agilentg公司；AG-245型十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒公司。

黄芩苷原料药（批号：20150301，20150302，20150303），颈复康药业集团有限公司自制；黄芩苷对照品，购于中国食品药品检定研究院，（批号：110715-201117）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 原料药中黄芩苷含量的测定

2.1.1 色谱条件：Kromasil C18色谱柱（250×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2），流速：1ml/min，检测波长：280nm，柱温：室温，进样量：10μl。

2.1.2 溶液的制备：⑴供试品溶液：精密称定黄芩苷原料药9mg，置100ml量瓶中，加入甲醇适量，加热溶解，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。⑵对照品溶液：取黄芩苷对照品6mg，精密称定，用甲醇稀释制成每1ml含60μg的溶液。

2.1.3 线性关系考察：精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成1.069mg/ml的贮备液，分别精密量取贮备液1ml、3ml、5ml、7ml、10ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按照2.1.1的色谱条件测定。以黄芩苷的浓度（X，μg/ml）对色谱峰面积（Y）进行线性回归，回归方程为：Y=43834X-270208，r=0.9973。表明黄芩苷在10.6922μg/ml～106.922μg/ml范围内，峰面积值与进样浓度呈良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验：精密吸取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积，分别计算平均值和相对标准偏差（RSD），结果黄芩苷对应峰面积平均值的RSD为0.91%（n=6），说明仪器的精密度良好。

2.1.5 重复性试验：精密称定黄芩苷原料药（批号：20150301）9mg，平行制备6份供试品溶液，按照2.1.1的色谱条件进样测定，结果RSD为1.63%，说明本方法的重复性良好。

2.1.6 回收率试验：取已经含量的黄芩苷原料药4.5mg（批号：20150301）6份，精密称定，分别加入4.5mg黄芩苷对照品，依法操作制备供试品溶液，按2.1.1的色谱条件进样测定，记录峰面积，计算回收率。结果平均回收率为99.7%（RSD=0.96%）。

2.1.7 原料药中主成分黄芩苷含量的测定：取3批黄芩苷原料药，分别按照2.1.2的方法制备供试品溶液。取供试品溶液及对照品溶液，按照2.1.1的色谱条件进样测定，每批样品均进样测定两次，使用外标法计算原料药中黄芩苷的含量。样品色谱见图1，含量测定结果见表1。结果表明本研究建立的含量测定方法准确、重现性好。

图1 原料药中主成分黄芩苷含量测定HPLC色谱图

表1 原料药中主成分黄芩苷含量测定结果

2.2 有关物质的测定

2.2.1 色谱条件：Kromasil C18色谱柱（250×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-水-磷酸（42：58：0.2），流速：1ml/min，检测波长：280nm，柱温：室温，进样量：10μl。

2.2.2 溶液的制备：⑴供试品溶液：精密称取黄芩苷原料药，加甲醇超声溶解并稀释制成每1ml含0.7mg的溶液，即得。⑵对照品溶液：精密量取供试品溶液1ml，置于50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 专属性试验：

⑴粗品检测：取粗品（批号20150301原料药精制前的样品），加甲醇超声溶解并稀释制成每1ml含0.7mg的供试溶液，按照2.2.1的色谱条件进样测定。用二极管阵列检测器在200～500nm下全波段检测，提取280nm波长下的色谱图，观察有关物质的分离情况，结果显示，主成分与相邻有关物质、有关物质与有关物质峰之间都能完全分离。

⑵降解产物的检测：精密称定160mg黄芩苷原料药（批号20150301），加甲醇超声溶解并稀释制成每1ml含1.6mg的溶液，均分成两份。一份稀释成每1ml含0.7mg的溶液，作为对照溶液；另一份加入适量0.1mol/ml的NaOH水溶液，摇匀，放置使其降解，当降解产物达20%左右时，用适量稀盐酸调pH值至中性，加甲醇制成与对照溶液相同浓度的溶液，作为降解后溶液。将上述两份溶液按照2.2.1的色谱条件分别进样测定，降解产物与主成分峰分离度应大于1.5%，主成分峰应纯净。结果显示，降解产物不干扰主成分峰，各降解产物均在杂质限度检查范围内。

⑶检测限的确定：采用信噪比法分别制备杂质和降解产物。将粗品检测试验中的供试溶液逐步稀释，直到有关物质中含量最小的一个峰响应值为仪器噪声的3倍左右，以此确定为粗品的检测限；将降解产物检测的降解后溶液逐步稀释，直到降解产物中含量最小的一个峰响应值为仪器噪声的3倍，以此确定降解产物的检测限。结果显示，粗品及降解产物的检测限分别为0.5μg、0.6μg，说明该方法检测灵敏度高，能够准确控制有关物质的限量。

图2 黄芩苷原料药中有关物质含量测定HPLC色谱图

2.2.4 原料药中有关物质含量的测定：取3批黄芩苷原料药，分别按照2.2.2的方法制备供试品溶液。取供试品溶液及2.2.2中的对照品溶液，按照2.2.1的色谱条件进样测定，有关物质色谱见图2，有关物质含量测定结果见表2。表明本研究建立的有关物质测定方法可靠、准确。

表2 原料药中有关物质含量测定结果

3 讨论

本研究在建立主成分含量检测方法的过程中，曾试验两个流动相系统，甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）与甲醇-水-冰醋酸（60：40：1），发现甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）流动相系统可以使主成分与相邻杂质峰较好分离，因此确定其为黄芩苷含量测定方法的流动相系统。本研究在建立有关物质检测方法的过程中，亦曾试验两个流动相系统，甲醇-水-冰醋酸（50：50：1）与甲醇-水-磷酸（42：58：0.2），发现甲醇-水-磷酸（42：58：0.2）流动相系统可以使有关物质与主成分峰分离度大于1.5%，且峰值最高，有关物质出峰最多，因此确定其为有关物质测定方法的流动相系统。

总之，本研究建立的HPLC法测定黄芩苷原料药中主成分和有关物质含量的方法，快速、简便、专属性强，能有效控制黄芩苷原料药的质量。