藤茶防腐抑菌作用的研究

邓新武 黄金光 张永强 邓 璨 欧阳名洋 周可人

（湖南省郴州市宜章县第一中学 湖南郴州 424200）

藤茶， 学名为显齿蛇葡萄（Ampelopisis grossedentata），是一种典型的类茶植物，俗称莓茶、山甜茶、白茶、甘露茶、白毛猴等，主要分布于广西、广东、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等省区［1－2］。 近年来，国内外对藤茶的研究，主要集中在藤茶中黄酮类、 蛇葡萄素和二氢杨梅素等有效成分的分离和提取，以及藤茶在抗氧化、降血压和调节免疫等方面的功效［3］。

有研究表明藤茶中的二氢杨梅素对大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用［4］。 藤茶对酵母菌、毛霉、青霉、曲霉等真菌是否也有抑制作用？目前并没有相关文献研究报道。本研究主要探究藤茶对酵母菌、毛霉、青霉和黑曲霉等真菌的抑制作用，具有一定的创新性和实用性。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料 馒头、牛奶、藤茶、发霉的橘子皮、发霉的面包等。

1.2 试剂与仪器 实验试剂包括马铃薯－肉汤培养基（PDA）、察氏培养基、琼脂、纳他霉素、酒精和蒸馏水；实验仪器包括高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱、恒温生化培养箱、摇床培养箱、超净工作台、电子天平、数码光学显微镜、超声波细胞破碎仪等。

1.3 实验方法

1.3.1 微生物的培养、纯化及初步鉴定 无菌条件下，分别从发霉的橘子皮、发霉的面包中挑取菌落接种至EP 管， 将EP 管置于振荡器上振荡，制成菌悬液。 将稀释后的菌悬液涂布至PDA 培养基上，28℃恒温箱培养2～3 d。 长出单菌落后，肉眼观察菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面的特征。挑取单菌落于显微镜下观察霉菌形态特征，包括菌丝结构、孢子特点、孢子囊的形态，进行初步鉴定。

1.3.2 不同提取方法及不同浓度的藤茶浸出液抑菌作用研究 按照表1 的方法制备藤茶常温无菌水提取物A、藤茶沸水提取物B、藤茶酒精提取物C、D 和E， 藤茶酒精提取物C、D 和E 的质量浓度分别为0.05 g／mL、0.1 g／mL 和0.15 g／mL。以上几种溶液使用前均进行过滤除菌处理。

表1 不同提取方法及其不同浓度的藤茶溶液

将分离纯化的酵母菌、青霉、毛霉和黑曲霉菌种活化后， 用无菌水稀释成含菌数约为108个/mL的菌悬液， 再用微量移液器吸取100 μL 菌悬液均匀涂布至PDA 固体平板。 用直径为7 mm 的无菌打孔器在每个PDA 平板十字形对称打4 个孔，按图1 所示，每一菌种每孔滴加藤茶提取物100 μL，28℃恒温箱培养3 d，测定抑菌圈的大小，每个菌种做5 个平行实验。 抑菌圈大小=抑菌圈直径－酒精的空白对照的抑菌圈直径－打孔器直径。

图1 PDA 平板打孔示意图（字母代表提取物类型）

1.3.3 食品防腐实验

1）分别量取150 mL 盒装纯牛奶倒入2 个烧杯中，用量筒量取25 mL 藤茶溶液倒入其中一个烧杯中，搅拌均匀，另一个烧杯加25 mL 蒸馏水作为对照组，将2 个烧杯置于昏暗室内。

2）取新鲜馒头掰成大小大致相等的两块，将其中一块完全浸入藤茶溶液中， 另一块浸入等量的蒸馏水中，处理10～15 s 秒后取出，将2 块馒头分别放在经高温杀毒后的2 个餐盘中， 置于昏暗的房间角落。 每天18∶30 观察牛奶及馒头腐败情况、有无异味，并记录结果。

图2 酵母菌显微照片（放大倍数：10×16）

图3 酵母菌PDA 平板菌落

图4 青霉菌显微照片（放大倍数：10×16）

图5 青霉菌查氏平板菌落

图6 黑曲霉显微照片（放大倍数：10×16）

图7 黑曲霉查氏平板菌落

图8 毛霉菌显微照片（放大倍数：10×16）

图9 毛霉菌PDA 平板菌落

2 结果与分析

2.1 微生物的初步鉴定 通过观察菌落特征及显微镜下观察（图2～图9），分离出酵母菌、青霉菌、黑曲霉和毛霉。

2.2 抑菌圈实验结果

2.2.1 藤茶浸出液不同提取方法抑菌作用研究3 种不同提取方法的抑菌结果如表2 所示。 表中所列数据为5 个重复平板抑菌圈直径的平均值（剔除了个别相差较大的数据）。

表2 不同提取方法的提取液对实验菌种的抑制作用

由表2 数据分析可知，3 种提取方法中，灭菌的常温蒸馏水（提取物A）不具有抑菌的作用，75%酒精（提取物C）效果最佳，沸水次之。沸水提取效果较差，可能与高温破坏相应物质结构有关，需进一步探究。

2.2.2 不同浓度的藤茶提取物抑菌作用研究由表3 数据分析可知， 不同浓度的藤茶浸出液对4 种实验菌种都有抑制作用， 其中对毛霉的抑制作用较弱，而对酵母菌的抑制作用较强。不同浓度的藤茶浸出液对同一菌种的抑制作用相差不大。典型的抑菌圈结果见图10。

表3 不同浓度的藤茶提取液对试验菌种的抑制作用

图10 酵母菌抑菌结果

2.3 食品防腐实验 食品防腐实验结果见表4。进行该实验的时间为2017年12月初，日平均温度约14℃， 所以普通的馒头和牛奶都不易变质；而添加了藤茶溶液的馒头、牛奶更不容易变质，说明藤茶溶液确实具有一定的防腐抑菌作用。

表4 藤茶浸出液对食品防腐的结果

3 讨论与展望

本实验以白酵母、青霉、毛霉和黑曲霉作为实验菌种， 探究了藤茶浸出液对这些菌种的抑制作用。 由于各平板中真菌生长速度不同，统计数据很不均一，有些平板数据差别较大，可能与滴加的藤茶溶液有关，也可能是滴加菌液后，涂布平板不均匀导致的。多次重复的结果都表明藤茶浸出液对酵母菌有较强的抑制作用， 而对毛霉抑制作用较弱，对青霉和黑曲霉也有一定的抑制作用。

藤茶能抑制酵母菌、青霉菌、毛霉和黑曲霉等微生物的生长，可以作为防腐剂开发利用，具有一定的潜在价值。 本研究小组计划下一阶段采用乙酸乙酯或超声波细胞破碎仪提取藤茶中的有效成分，进一步地分离提纯，分析究竟是哪些物质或物质组合具有抑菌作用。 藤茶为天然植物（中药），是生物源防腐剂， 既可达到抑菌的效果又不会对人体产生不利影响，可广泛用于食品添加剂、衣物防腐剂等。