阿魏酸钠对局灶性脑缺血大鼠神经功能及脑梗死面积的影响

林志坚 董姣璇 程 欣 王怡平 吴 军

阿魏酸(ferulic acid, 化学名称为3-甲氧基-4-羟基丙烯酸)普遍存在于当归、川芎、酸枣仁、蜂胶等中草药材中，具有抗血小板聚集，解除血管平滑肌痉挛，抗氧化和清除氧自由基，提高膜稳定性，以及抗炎、镇痛、调节免疫功能、利肝保湿等药理作用[1,2]。近年来，阿魏酸钠在脑梗死的治疗作用越来越引起人们的关注[3]。本研究旨在探讨阿魏酸钠(sodium ferulate，SF)对局灶性脑缺血大鼠神经功能及脑梗死面积的影响。

材料与方法

1.实验动物与分组:健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，体重250～300g，50只，由北京大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0010。随机方法分为5组，即假手术组、模型组、低剂量SF组、中剂量SF组及高剂量SF组，每组10只。

2.试剂：阿魏酸钠注射液(中国药品生物制品检定研究所)；2%TTC染色液(上海晶美生物科技有限公司)。

3.动物模型的制备：采用传统改良的大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血(MCAO)大鼠模型，腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg)进行麻醉，仰卧固定于鼠板上，颈部正中皮肤予强力碘消毒，做一2.5～3.0cm的切口，钝性分离出右侧颈总动脉及颈内、颈外动脉，结扎颈总动脉和靠近气管的颈外动脉,然后在颈总动脉分叉下方约3mm处剪一小切口，插入头端烧成钝圆形0.25mm尼龙线，大约进入17～20mm,在大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉，然后结扎固定，缝合切口，在切口及周围涂布抗生素[4]。假手术组仅切开皮肤,分离右侧颈总动脉后即缝合。术后将动物放回清洁的饲养笼中，如果动物死亡则随机补充造模。

4.给药方法:(1)假手术组：仅切开皮肤,分离右侧颈总动脉后即缝合；每日股静脉滴注等体积无菌生理盐水。(2)模型组：建立MCAO模型，每日股静脉滴注等体积无菌生理盐水。(3)低剂量SF组：建立MCAO模型，每日股静脉滴注20mg/kg SF共7天。(4)中剂量SF组：建立MCAO模型，每日股静脉滴注50mg/kg SF共7天。(5)高剂量SF组：建立MCAO模型，每日股静脉滴注100mg/kg SF共7天。低剂量、中剂量及高剂量SF的浓度参考文献[5,6]报道确定。

5.神经功能评估:运用改良的神经功能缺损评分法(mNSS)观察SD大鼠神经行为学变化情况，最高分数18分，分数越高提示神经功能损伤越严重[7]。

6.脑梗死面积计算：大鼠腹腔注射水合氯醛(4ml/kg)麻醉固定,从背面剪下头部取出大脑，用0.01mol/L PBS(大约100ml)冲洗后放入-34℃冰箱内快速冷冻30min，自脑前极与视交叉连线中点处和漏斗柄与后叶尾极之间，做冠状切片，每2mm切1片，一般切5～6片，置于2%TTC中，37℃避光水浴20～30min。使用Image J软件计算脑梗死面积。

结 果

1.各组治疗前后mNSS比较:治疗前模型组、低剂量SF组、中剂量SF组及高剂量SF组mNSS比较，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后模型组与低剂量SF组生理盐水治疗后mNSS比较，差异无统计学意义(P>0.05)。中剂量SF组及高剂量组SF治疗后mNSS与低剂量SF组治疗后比较，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后高剂量SF组与中剂量SF组mNSS比较，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 各组治疗前后mNSS比较

与低剂量SF组比较，*P<0.05；与中剂量SF组比较，#P<0.05

2.各组治疗前后脑梗死面积的比较:各组大脑TTC染色，假手术大脑正常组织呈红色，模型组梗死组织颜色苍白(图1)。治疗前模型组、低剂量SF组、中剂量SF组及高剂量SF组脑梗死面积，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后模型组与低剂量SF组生理盐水治疗后脑梗死面积比较，差异无统计学意义(P>0.05)。中剂量SF组及高剂量组SF治疗后脑梗死面积与低剂量SF组治疗后比较，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后高剂量SF组与中剂量SF组脑梗死面积比较，差异有统计学意义(P<0.05),详见表2。

图1 TTC染色A.假手术组大脑组织呈红色；B.模型组大脑梗死组织呈苍白色(箭头所示)

组别n治疗前治疗后假手术组100.00±0.000.00±0.00模型组1043.27±7.7141.33±6.91低剂量SF1042.44±7.5439.75±6.52中剂量SF1040.87±2.9821.55±5.43∗高剂量SF1041.79±3.2618.23±4.99∗#

与低剂量SF组比较，*P<0.05；与中剂量SF组比较，#P<0.05

讨 论

脑卒中是当今威胁人类健康的三大疾病之一，其发生率、病死率、致残率均高，在我国位居首位[8]。如何有效的救治脑卒中患者一直是研究的热点,在有限的时间窗内进行静脉溶栓或者机械取栓可改善患者预后，但是价格较为昂贵，且偏远地区条件尚未成熟[9]。阿魏酸是桂皮酸的衍生物之一，也是植物来源的一种酚酸，在细胞壁中与多糖和蛋白质结合成为细胞壁的骨架。阿魏酸是阿魏、川芎、当归、升麻、木贼、莱菔、酸枣仁等多种中草药的有效成分之一。

本研究发现，中剂量SF组及高剂量组SF治疗后mNSS与模型组治疗后比较有明显的下降，差异有统计学意义，提示中剂量SF及高剂量SF具有改善局灶性脑缺血大鼠的神经功能。SF改善MCAO大鼠神经功能具体机制尚未明确，可能从多种途径发挥作用。缺血性脑卒中是脑动脉闭塞或者栓塞导致脑组织缺血、缺氧的一种急性脑血管病，其病理生理过程十分复杂，包括一系列的炎性反应、细胞凋亡、神经细胞电活动消失、能量代谢障碍、血管再生等[10]。

研究表明，SF可清除氧自由基产生，防止脂质过氧化，抑制多种炎性因子形成，从而起到神经保护作用。SF也是一种非肽类内皮素受体拮抗剂，脑缺血、缺氧发生时，血管内皮细胞受损后，内皮素生成增多。SF可降低血浆内皮素的浓度，还可拮抗内皮素引起的血管收缩、升压及血管平滑肌细胞增殖，促进一氧化氮的合成，松弛血管平滑肌，扩张血管，改变血液流变学特征，从而减轻脑缺血损伤程度[11]。脑缺血时神经细胞凋亡除了与氧自由基产生、钙超载、线粒体损伤等相关，凋亡过程受基因调控，已知相关基因有bc1-2、p53、Fas等基因家族，各种基因在细胞凋亡过程中作用各不相同，有研究发现SF能增加bc1-2表达，减少Bar表达，从而抑制细胞凋亡的发生，SF尚能剂量依赖性地降低Par-4及caspase-3基因的mRNA的表达水平，而过氧化氢通过促进caspase-3及Par-4蛋白的激活来诱发细胞凋亡，这可能是SF对抗过氧化氢引起的神经毒性的作用机制[12]。

本研究还发现中剂量SF及高剂量组SF治疗后脑梗死面积与模型组治疗后比较亦有明显下降。SF具有减小MCAO大鼠脑梗死面积的作用。急性脑梗死病灶中心区以神经元坏死为主，周围则是缺血半暗带(ischemia penumbra)，后者有大量存活的神经元，故尽快恢复缺血半暗带供血是缺血性脑卒中治疗的关键[13]。SF可能通过减少缺血半暗带神经细胞凋亡，挽救一定数量的神经细胞，从而减小脑梗死面积。血小板的黏附和聚集以及血栓的形成是缺血性脑卒中形成中重要的病理生理过程，花生四烯酸是血小板活化的重要因素。有研究表明，SF和阿司匹林合用可显著降低脑梗死患者血浆中血栓素A2(TXA2)与前列环素(PGI2)的比值,TXA2促进血小板聚集,而PGI2抑制血小板聚集， TXA2与PGI2的比值降低可抑制血小板的活化聚集，对脑梗死的防治具有一定的作用。SF抗血小板聚集、抗血栓形成及缩小梗死面积等作用可能与调节TXA2和PGI2平衡有密切关系。

本研究发现，治疗后高剂量SF组与中剂量SF组mNSS及脑梗死面积比较，差异有统计学意义，提示高剂量SF对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用及减少脑梗死面积优于中剂量组，可能存在一定的量效关系。本研究的局限性在于仅观察SF对MCAO大鼠神经功能及脑梗死面积的影响，而未进一步从分子角度探讨其机制，这也是本课题组今后研究的方向之一。

综上所述，本研究发现中剂量SF及高剂量SF对局灶性脑缺血大鼠神经功能恢复具有一定的促进作用，同时也减小脑梗死面积，提示SF在缺血性脑卒中的治疗具有一定的治疗作用。