印迹零流电位法测定邻甲氧基苯胺

马明明，梁娟丽，苏新科，杜 茹

西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安 710048

邻甲氧基苯胺(o-methoxyaniline, OMA)又称2-甲氧基苯胺，化学结构式如图1．作为医药和化工原料，OMA经常被用于合成高分子聚合物和染料等．但由于OMA具有潜在的致癌性，已被列入24种潜在致癌芳香胺中，因此，对OMA的日常监测非常重要．目前采用的方法主要有分光光度法[1]、气质联用[2]和高效液相色谱法[3]等．然而，分光光度法的选择性较差、灵敏度较低；色谱仪器本身昂贵且检测周期长、检测过程操作繁琐．因此，探索检测灵敏度高、选择性好、操作简便的OMA检测方法势在必行．

图1 邻甲氧基苯胺的化学结构式Fig.1 Molecularly structure of OMA

零流电位法是导电材料两端分别与工作电极和辅助电极相端口连接，与参比电极同时浸入溶液后组成新的检测回路，对其施加线性扫描电位后，根据其I-E曲线上I=0时的电位值(即零流电位EZCP)[4]进行测量的一种新型检测技术．目前，零流电位法已经用于测定4-氨基偶氮苯[5]、 邻甲苯胺[6]、 联苯胺[7]、 pH值[8-11]、 脱氧核糖核酸[12]和人血清蛋白[13]． 此外，零流电位法还可以研究物质之间的相互作用[14-16]及在滴定法中的应用[17-18]等．

分子印迹技术是采用人工方法制备具有特定空间结构空穴，对特定分子(印迹分子和模板分子)具有专一识别及结合作用的印迹聚合物(molecularly imprinted polymer, MIP)的技术．当模板分子与功能单体接触时会形成多重作用点，聚合过程使这种作用点被记忆，除去模板分子后，聚合物中形成了与模板分子空间结构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这些印迹空穴对模板分子具有特定识别与选择性．将制备出的印迹聚合物修饰在电极表面，可以高选择检测血清的四环素(tetracycline，TC)[19]、胰岛素[20]、双酚A[21]、环境介质中的甲基对硫磷[22]，以及药物沙丁胺醇[23]、芦丁[24]和三聚氰胺[25]等．

此外，石墨烯等新型纳米材料也被应用在MIP电化学传感器的制备中，以增强电极界面电子传递速率，提高传感器灵敏度．DUAN等[26]采用硅烷化磁性氧化石墨烯分子印迹聚合物制备电化学传感器检测多巴胺的选择性发光；LI等[27]采用磁性石墨烯印迹传感器测定日落黄；XIE等[28]采用石墨烯分子印迹电化学传感器测定谷物中的噻虫嗪；XIA等[29]基于壳聚糖/离子液体-石墨烯复合材料修饰的分子印迹电化学生物传感器测定牛血清白蛋白；ENSAFI等[30]用石墨烯量子点印迹聚合物电化学传感器测定甲硝唑．

鉴于此，本研究在石墨烯修饰的铅笔芯电极表面(graphene-modified pencil electrode，G-PEC)，采用电聚合方式制备出OMA分子印迹聚合物零流电位传感器(OMA-MIP-modified G-PEC，即OMA-MIP/G-PEC)，如图2．通过MIP与模板分子OMA的重新印迹结合吸附引起传感器零流电位的变化检测OMA浓度．

图2 MIP电极制备过程Fig.2 Preparation process of MIP electrode

1 实 验

1.1 试剂与仪器

支持电解质为PBS(phosphate buffer solution)缓冲溶液(Na2HPO4-KH2PO4)；4-氨基联苯、4-氨基偶氮苯和对氯苯胺均购自阿拉丁试剂网；2,4-二甲基苯胺和OMA购自西亚试剂网；丙烯酸和胭脂红购自中国天津市福晨化学试剂厂；联苯胺购自天津市科密欧化学试剂有限公司．邻甲苯胺购自上海山扑化工有限公司；丙烯酰胺购自天津市红岩化学试剂厂；石墨烯购自杭州格蓝丰纳米科技有限公司；以上试剂均为分析纯．试验所用水均为二次蒸馏水．2B铅笔芯购自中国第一铅笔制造公司．CHI610D型电化学工作站购自中国上海辰华仪器厂；KQ-250DB型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司．电聚合采用三电极系统：饱和甘汞电极为参比电极(saturated calomel electrode，SCE)，铂电极为辅助电极，铅笔芯电极为工作电极．

1.2 邻甲氧基苯胺印迹聚合物石墨烯修饰铅笔芯电极的制备

具体制备步骤如下：① 将预处理过的铅笔芯先浸入0.50 mg/mL石墨烯水分散液10 min后，用二次蒸馏水冲洗电极表面的残液，晾干；② 将处理后的铅笔芯浸入0.50 mg/mL石墨烯石蜡分散液，10 min后取出用二次蒸馏水洗涤，电极表面干燥后即成为石墨烯修饰的铅笔芯电极G-PEC；③ 将G-PEC置入PBS溶液(pH=7.38，含4.00×10-3mol/L OMA和1.60×10-2mol/L丙烯酰胺)中，扫描电位范围为-1.2～1.2 V，以0.1 V/s扫描速率循环扫描16圈；④ 用二次蒸馏水清洗数次后，再将其置于无水乙醇中超声波清洗4 min，即可得OMA-MIP/G-PEC．

非印迹电极OMA-NMIP/G-PEC制备方法同上，但没有模板分子OMA．

1.3 实验方法

按图3方式，将OMA-MIP/G-PEC串联并入CHI610D电化学工作站的工作电极端和辅助电极端，以饱和甘汞电极为参比电极，构建成一个检测回路，OMA-MIP/G-PEC在一定浓度的OMA溶液中静置4 min后再进行线性扫描，记录I-E曲线中的EZCP． 每次测试完后将电极置于无水乙醇中超声波清洗4 min，以备下次使用．

TRE为参比电极的端口；TWE为工作电极；TCE为辅助电极图3 OMA-MIP/G-PEC零流电位传感器示意图Fig.3 Diagram of OMA-MIP/G-PEC interfacial potentiometry with double poles sensor

2 结果与讨论

2.1 OMA-MIP制备条件的优化

2.1.1 扫描电位范围和模板分子浓度的优化

OMA-MIP的印迹空穴能印迹吸附OMA，而裸电极没有这样的印迹吸附作用，界面电位与印迹电极自然不同，因此，可通过求出两种电极的零流电位差值(ΔEZCP)优化制备条件．ΔEZCP越大，说明印迹电极的印迹识别结合性越好．因此，本研究取ΔEZCP的最大值作为优化的最佳指标.

扫描电位范围和OMA浓度会影响印迹聚合物的印迹位点数量，继而影响印迹电极对OMA的选择性识别. 考察了扫描电位范围分别为-0.60～0.60、-0.80～0.80、-1.00～1.00、-1.20～1.20、-1.40～1.40、-1.60～1.60和-1.80～1.80 V时，ΔEZCP的变化，结果如图4．由图4还可见，随着扫描电位范围的增大，ΔEZCP逐渐增加，并在-1.2～1.2 V处达到最大；当超出-1.2～1.2 V后， ΔEZCP逐渐变小，因此，最佳扫描电位范围为-1.2～1.2 V．图4也显示，OMA浓度为6.00×10-4～1.00×10-2mol/L时对ΔEZCP的影响．由图4可见，当OMA浓度为6.00×10-4～4.00×10-3mol/L时，随OMA浓度增加，ΔEZCP相应增大，在4.00×10-3mol/L处ΔEZCP达到最大值；但当OMA浓度大于4.00×10-3mol/L，随着浓度增加， ΔEZCP反而下降， 因而聚合反应中OMA的浓度选择为4.00×10-3mol/L．

图4 扫描电位范围和OMA浓度对ΔEZCP的影响Fig.4 Effects of scan potential range and concentration of OMA on ΔEZCP

2.1.2 功能单体、模板分子配比和扫描圈数的优化

功能单体与模板分子的配比对印迹电极上印迹聚合物的形状和印迹位点数起决定性的作用．印迹聚合物厚度直接影响传感器的稳定性和灵敏度，而厚度可以由扫描圈数控制．当OMA与丙烯酰胺浓度配比为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8和1∶10时，印迹聚合物ΔEZCP的变化及扫描圈数对ΔEZCP的影响如图5．由图5可知，当配比为1∶4时，ΔEZCP达到最大值，因此，最佳配比是1∶4；当扫描圈数为6～16圈时，ΔEZCP逐渐增加并在16圈时达到最大，但超过16圈时，ΔEZCP开始下降，因此，最佳扫描圈数是16圈．

图5 OMA与丙烯酰胺的浓度配比和 循环圈数对ΔEZCP的影响Fig.5 The influence of molar concentration (OMA and acrylamide) and scan cycles on ΔEZCP

2.1.3 PBS pH值和洗脱时间的优化

模板分子与功能单体在聚合反应中的结合受缓冲溶液pH值影响较大．PBS溶液pH值分别为5.91、6.24、6.47、6.98、7.38和7.73时，对ΔEZCP的影响结果如图6．由图6可见，当PBS溶液的pH<7.38时，ΔEZCP随pH值增加逐渐增加，而当PBS的pH>7.38时，ΔEZCP随pH值的增加却减小，因此，pH=7.38为最优值．

图6 pH值和洗脱时间对ΔEZCP的影响Fig.6 The influence of pH and elution time on ΔEZCP

洗脱过程就是去除模板分子，使有效识别位点得以释放，从而获得与模板分子结构和空间相同的三维空隙，而洗脱时间会影响分子印迹聚合物上的三维空隙．考察了洗脱时间为1～6 min时对ΔEZCP的影响．从图6可见，在2～6 min内，当洗脱时间小于4 min时，ΔEZCP随洗脱时间的延长而增大；超过4 min后ΔEZCP几乎不变，说明此时在印迹聚合物上的有效位点吸附OMA已达到饱和，因此，洗脱时间选择为4 min．

2.2 印迹传感器的伏安性能

2.2.1 三种传感器的比较

为考察印迹传感器的伏安特性，本研究分别考察了OMA在OMA-MIP/G-PEC、OMA-NMIP/G-PEC和G-PEC上的氧化还原反应，图7是浓度为5.00 μmol/L的OMA在上述3种电极上的循环伏安曲线．如图7曲线a，OMA在OMA-MIP/G-PEC上有一个显著的氧化峰，峰电流大约是2.57×10-4A，这是因为OMA-MIP/G-PEC上含有大量与OMA模板分子形状匹配、大小适合且有相互作用功能基团的三维空隙，使溶液中的OMA很容易被选择性印迹吸附到电极表面的空穴中发生氧化反应；而非印迹聚合物电极(曲线b)上并没有印迹空穴，只是非印记聚合物的存在增大了电极面积，使少量OMA可以发生氧化反应，因此氧化峰电流很小；裸石墨烯修饰铅笔芯电极相比前两个电极，电子传递速率相对较低，因而没有观察到OMA的氧化峰(曲线c)．

图7 OMA-MIP/G-PEC、OMA-NMIP/G-PEC 和 G-PEC分别在含5.00 μmol/L OMA、 pH=7.38 PBS中的循环伏安曲线Fig.7 Cyclic voltammograms of OMA-MIP/G-PEC, OMA-NMIP/G-PEC and G-PEC in PBS, pH=7.38 containing 5.00 μmol/L OMA

2.2.2 OMA-MIP/G-PEC的多次超声清洗差分脉冲伏安曲线

为说明多次超声清洗对OMA-MIP/G-PEC的影响，用同一根OMA-MIP/G-PEC连续9次超声清洗后分别测4.00×10-3mol/L OMA的差分脉冲伏安曲线的变化，结果见图8．由图8可见，清洗9次后，氧化峰电位基本不变．9次峰电流值的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)是3.35%，说明OMA-MIP/G-PEC精密度好，可多次超声清洗不影响传感器的反复使用．

图8 九次超声清洗后，OMA-MIP/G-PEC在含4.00× 10-3 mol/L OMA、pH=7.38的PBS溶液中的 差分脉冲伏安曲线Fig.8 Differential pulse voltammetry curves of OMA-MIP/G-PEC in PBS, pH=7.38 containing 4.00× 10-3 mol/L OMA with 9 successive ultrasonic elution

2.3 OMA-MIP/G-PEC选择性

印迹容量表示分子聚合物对底物分子的吸附结合性大小[31]. 本研究印迹容量计算式为

印迹容量=ΔE/E0

(1)

其中， ΔE为OMA-MIP/G-PEC在OMA中的EZCP与在空白PBS中EZCP的差值；E0表示该电极在空白PBS中的EZCP．考察了OMA-MIP/G-PEC在OMA及其结构相近物质，如4-氨基甲苯(p-toluidine， PTD)、对氨基偶氮苯(4-aminoazobenzene，4-AAB)、 4-氯苯胺(p-chloroaniline， PCA)、 邻甲苯胺(o-toluidine， OT)、 邻联甲苯胺(o-tolidine，OTD)、 联苯胺(benzidine， BZ)和胭脂红(carmine， CME)中的印迹容量，计算结果见图9．由图9可知，OMA-MIP/G-PEC在OMA中的印迹容量最大，说明OMA-MIP含有与OMA形状匹配、大小相同的三维空隙，可以对OMA产生选择性强的印迹吸附，能够将大量溶液中的OMA吸附到印迹空穴内；而对其他几种结构相似物质由于没有印迹吸附作用，只是非印迹吸附，因而印迹容量要比OMA小得多.

图9 不同物质在OMA-MIP/G-PEC印迹容量Fig.9 The imprinting capacity of different substance on OMA-MIP/G-PEC

2.4 分析应用

2.4.1 标准曲线和检测限

考察OMA-MIP/G-PEC对不同浓度OMA的零流电位响应．图10(a)为OMA-MIP/G-PEC在不同浓度OMA溶液中的I-Eapp曲线,Eapp为表观界面电位．如图10(a)，随OMA浓度的加大，EZCP正移，当OMA的浓度为0.001～50.00 μmol/L时，EZCP与OMA浓度的对数lg [c(OMA)]呈线性关系，即

EZCP=-0.025 67 lg[c(OMA)]-0.104 05

(2)

其中，c(OMA)为OMA浓度；R为相关系数，R=0.99；n为样品个数，n=10． 如图10(b)，检测限为0.64 nmol/L (3σ/k)．

图10 OMA-MIP/G-PEC在不同c(OMA)中的 I-Eapp曲线及EZCP与lg[c(OMA)]的线性关系曲线Fig.10 I-Eapp curves of OMA-MIP/G-PEC in OMA solutions with different concentrations and the linear plot of EZCP and lg [c(OMA)]

2.4.2 OMA-MIP/G-PEC的重现性与稳定性

用5根OMA-MIP/G-PEC分别检测10.00 nmol/L的OMA，结果表明，5次测量的EZCP相对标准偏差是1.45%，因此传感器的重现性好；用同一根OMA-MIP/G-PEC每隔2 d测试10.00 nmol/L的OMA，连续10次测量的EZCP的相对标准偏差是0.95%，可见传感器稳定性好．

2.4.3 干扰试验

考察了废水中可能存在与OMA结构类似的物质及金属阳离子对OMA-MIP/G-PEC测定OMA的影响，试验结果见表1．从表1可见，4-AAB、CME、PCA、OT、OTD、BZ及二价金属离子Cu2+、Mg2+和K+不干扰OMA测定，因而OMA-MIP/G-PEC选择性好．

2.4.4 样品测定

用加标实验测定含有OTD、PCA、OT、BZ、CME和4-AAB的废水样品中的OMA浓度，结果见表2．从表2可见，平均回收率为95.20%～105.72%，结果满意．

表1 不同干扰物质对OMA测定的影响

表2 废水样品中OMA浓度测定结果

结 语

综上研究表明，在零流电位法下，采用电聚合法制备的OMA-MIP/G-PEC传感器，可以借助OMA-MIP的印迹空穴，对模板分子OMA的特异选择性印迹吸附所引发的零流电位变化，监测废水中痕量OMA．本传感器除灵敏度高、选择性好外，还具有稳定性和重现性好、操作简单的优异性能，未来有望进一步检测其他复杂体系中的OMA．