HPLC法测定蔬菜中3种喹诺酮类抗生素

罗 洁，罗 可，邹小翠，彭敏婕，阮晓玲

（长沙医学院，湖南长沙 410219）

0 引言

喹诺酮类抗生素（QNs）作为抗菌药物被广泛用于人和动物感染性治疗中[1-2]。喹诺酮类抗生素使用后多以药物原型或代谢产物随尿粪排出，由于难以降解，成为有机环境污染物[3]，污染了水域[4-5]和土壤环境[6-7]，特别是在动物类食品中抗生素残留污染问题尤为严重，且已经得到了社会的广泛关注[8]。我国限定动物类食品中喹诺酮类抗生素（环丙沙星和恩诺沙星)最高残留标准为（100 μg/kg）[9]。诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）和恩诺沙星（ENR）是近年来较常见的3种人畜共用的QNs类抗生素，对该类抗生素在动物类食品中残留的分析方法研究较多[10-11]，而在蔬菜中残留的分析方法鲜有报道[12-13]。针对蔬菜中这3种喹诺酮类抗生素的检测建立了较快捷、简便的高效液相色谱（HPLC）分析方法，并采用该方法对市售蔬菜中此类抗生素污染及其对人体健康风险问题进行了探讨，以期为蔬菜中喹诺酮类抗生素的检测分析和健康风险评价提供更可靠的试验依据。

1 仪器与试剂

LC-20A型高效液相色谱仪，岛津公司产品；C18色谱柱，江苏汉邦科技有限公司产品；BSA124S型分析天平，德国赛多利斯公司产品；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器责任有限公司产品；AS系列超声仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司产品；ZWB-LS1-40型超纯水机，湖南中沃水务环保科技有限公司产品。

诺氟沙星对照品（纯度均>98%，批号D1712037）、恩诺沙星对照品（纯度均>98%，批号C1731069）、环丙沙星对照品（纯度均>98%，批号C1703096），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；乙腈（HPLC），天津康科德科技有限公司提供；磷酸（AR）、乙酸（AR），天津市恒兴化学试剂制造有限公司提供；实验室用水为超纯水。

2 色谱条件

色谱柱为HederaODS-2 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈：0.1%甲酸水溶液（20∶80 V/V），流速1 mL/min，检测波长280 nm，柱温25℃，进样体积20 μL。

3 溶液的配制

3.1 对照品溶液的制备

精密称取诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星对照品约5 mg，分别置于25 mL棕色容量瓶中，加入少量流动相配比溶液后超声处理10 min助溶，流动相溶液定容，得质量浓度0.2 mg/mL的对照品储备液；分别精密移取1 mL上述3种对照品溶液置于20 mL棕色容量瓶中，用流动相溶液定容至刻度，即得质量浓度0.01 mg/mL的混合对照储备液于4℃下保存备用。

3.2 样品前处理

用清水洗涤蔬菜样本，再用实验室自制超纯水反复清洗3次，晾干后研磨粉碎。精密称取约5 g置于烧杯中，加入20 mL提取液（乙酸∶乙腈4∶96，V/V），保鲜膜密封烧杯口，置于超声仪中超声提取15 min，取出静置冷却15 min，过滤，滤液置于蒸发皿中于90℃下蒸干，移取2 mL流动相溶液复溶，过0.45 μm微孔滤膜过滤，置于EP管中备用。

4 方法学验证

4.1 专属性试验

取混合对照溶液和油麦菜样品溶液各20 μL注入液相色谱仪中，在上述色谱条件下进行测定。诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的保留时间分别为6.23，6.96，9.51 min，3种成分峰形较好、分离度良好。

3种抗生素对照品HPLC图见图1，油麦菜空白对照的HPLC图见图2。

4.2 标准曲线及定量限和最低检测限

取10 g/mL混合对照溶液储备液用空白蔬菜汁（上述前处理得到）与流动相的混合溶液稀释，得到0.2，0.6，1.0，4.0，8.0，10.0 g/mL系列质量浓度混合对照液，分别取20 μL进行HPLC分析。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数。以倍噪比（S/N=3）为最低检测限LOD，以倍噪比（S/N=10）为定量限LOQ。

3种抗生素的线性关系、检测限和定量限见表1。

图1 3种抗生素对照品HPLC图

图2 油麦菜空白对照的HPLC图

表1 3种抗生素的线性关系、检测限和定量限

在0.3～10.0 g/mL质量浓度范围内，3种喹诺酮类抗生素线性关系良好，相关系数均大于0.999；3种喹诺酮类化合物的检出限为60～120 g/kg，定量限为180～360 g/kg。

4.3 精密度试验

取已配置好的混合对照储备液在上述条件下重复进样6次，进样20 μL，测得诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星的峰面积RSD值分别为0.47%，0.37%，0.39%，表明仪器精密度良好。

4.4 稳定性试验

取已配置好的混合对照储备液，按设定的色谱条件，分别于质量浓度0，0.5，1.5，3.0，5.0，8.0，10.0 g/mL进样分析，测得3种成分的峰面积RSD值分别为1.39%，1.34%，1.70%，说明3种喹诺酮化合物在10 h内稳定性良好。

4.5 加样回收率试验

取“3.2”中的供试品匀浆5 g置于25 mL棕色容量瓶中，平行3份，加入标准限度100 μg/kg的喹诺酮抗生素对照品，分别进样测定分析，计算回收率，得到各成分的加标回收率均在92%～94%，且RSD值均≤3%，证明该方法的回收率较好。

3种抗生素的加样回收率试验（n=3）见表2。

表2 3种抗生素的加样回收率试验（n=3）

4.6 不同种类蔬菜的回收率

不同品种蔬菜中的叶绿素、蛋白质、植物脂肪等物质的含量分布会对喹诺酮类抗生素的提取、净化等效果造成一定影响。试验仅对生菜、茼蒿和油麦菜中3种QNs类抗生素的加标（100 μg/kg）回收率进行检测。加标回收试验结果显示，其中CIP的回收率均在80%左右，ENR在62%～65%，NOR均在70%以上。因此，该方法能够适用于不同品种蔬菜中喹诺酮类抗生素分析检测的要求。

5 实际样品质量浓度测定

购买市场上3种不同蔬菜样品，按照上述的样品制备方法进行前处理后，在设定的色谱条件下测定蔬菜中3种喹诺酮类抗生素的质量浓度。

蔬菜中3种QNs类抗生素质量浓度测定结果见表3。

表3 蔬菜中3种QNs类抗生素质量浓度测定结果

在油麦菜未检测出3种成分，在生菜及茼蒿中检测到了一定量的环丙沙星和诺氟沙星，质量浓度在0.1～0.5 μg/mL，均超出了我国动物性食品中的最高残留限量（100 μg/kg），由此可看出，蔬菜中的确含有该类喹诺酮类抗生素，且对人类健康存在隐患。所以，蔬菜等食品中QNs类抗生素的富集情况应该得以重视。

6 结果与分析

6.1 样品前处理条件的选择

6.1.1 提取液的选择

对蔬菜（大白菜）样品（5.0 g）以20 mL不同配比的提取液进行提取，绘制得到3种QNs类抗生素的加样回收率。

提取液种类对喹诺酮类抗生素回收率的影响见图3。

图3 提取液种类对喹诺酮类抗生素回收率的影响

由图3可知，3种不同配比的提取液对蔬菜中3种QNs类抗生素的加样回收率均大于70%，其中提取液a对恩诺沙星和诺氟沙星的回收率差异不大，但这3种提取液中，提取液a对环丙沙星的回收率是最高的，且回收率在80%以上。因此选择提取液a用于提取蔬菜样品中的QNs类抗生素。

6.1.2 提取时间的选择

提取时间往往直接决定提取液与固体颗粒的接触面积和接触程度，接触面积愈大且接触程度越好，则提取效率愈高。但试验结果表明，当提取时间超过15 min后，提取时间对提取效果的影响并不大。所以，选择15 min作为提取时间。

提取时间对喹诺酮类抗生素回收率的影响见图4。

图4 提取时间对喹诺酮类抗生素回收率的影响

6.2 流动相的选择

喹诺酮类抗生素的流动相的pH值与解离状态。在强酸介质（pH值＜3）中，QNs类抗生素为强阳离子；当pH值为3～4时，QNs类抗生素则呈两性离子形式；但当pH值为中性时，QNs类抗生素又表现为弱阴离子；且在碱性条件下，QNs类抗生素为阴离子形式。所以，流动相的pH值对QNs类抗生素在色谱柱上的保留时间和分离度有较明显的影响，试验表明流动相中加一定酸性溶液，这3种QNs类抗生素的峰形会得到改善。所以，选择以乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，并使用等度洗脱方式来实现3种QNs类化合物的良好分离。