响应面法优化丹酚酸B提取工艺

赵孟浩，孙国杰*

河北科技大学生命科学与工程学院（石家庄 050018）

丹参是唇形科多年生草本植物。丹参中含有两类主要成分，一类是脂溶性的丹参酮类，另一类是水溶性的丹酚酸类。丹酚酸类物质中以丹酚酸B为主要成分。通过试验表明丹酚酸B具有保护心肌，抗肝纤维化的药理作用，已被广泛应用于心脑血管等多种疾病的治疗[1]。丹酚酸B是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一[2]。

响应面设计与传统的均匀设计和正交设计相比，响应面法具有试验精度高、试验次数少、数学模型预测性好等优点[3]。对试验进行全面研究，通过回归方程分析和图形分析[4]，得到最佳优化条件。因此，通过响应面法优化丹酚酸B提取工艺，为更加高效提取丹酚酸B提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Waters 1525高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；UPR-11-10 T优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；DF-101集热式恒温加热磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司）；JJ 200型天平（常熟市双杰测试仪器厂）；GM-0.33 II隔膜真空泵（天津市金腾实验设备有限公司）；PL 203电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ 5200 DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料与试剂

紫花丹参（河北石家庄灵寿县）；丹酚酸B标准品（含量94.1%，中国食品药品检定研究院）；甲醇（Fisher Chemical）；乙腈（Fisher Chemical）；超纯水；磷酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 丹酚酸B的提取

将丹参避光阴干，粉碎，过3号筛（筛孔尺寸0.300 mm），精确称取10 g于250 mL圆底烧瓶中，按照一定液料比、提取温度和提取时间进行加热回流提取，提取1次。提取后用滤纸过滤。得到样品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备

将1.3.1小节得到的样品溶液用水定容至500 mL，过0.22 μm的滤膜，得到供试品溶液。

1.3.3 对照品溶液的制备

精密称定丹酚酸B对照品适量，加甲醇制备成质量浓度为1.006 mg/mL的对照品溶液。

1.3.4 丹酚酸B的含量测定

1.3.4.1 色谱条件

色谱条件参照药典[5]。色谱柱：Waters Symmetry C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相：乙腈-0.05%磷酸水。梯度洗脱程序：0～15 min，17%～23%乙腈，15～30 min，23%～25%乙腈，30～40 min，25%～90%乙腈。流速1.0 mL/min；检测波长286 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

1.3.4.2 标准曲线的制备

将1.006 mg/mL的标准稀释成0.503，0.402，0.302和0.201 mg/mL的标准品溶液，进样20 μL，测定峰面积，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.5 单因素试验

称取10 g丹参粉末，其他因素不变情况下，分别考察料液比、提取温度、提取时间对丹酚酸B的提取量的影响。筛选出各因素的最佳条件。试验中料液比用丹酚酸B含量为纵坐标，提取温度和提取时间则采用峰面积做纵坐标。

1.3.6 响应面试验设计

根据单因素试验结果，选择合适的单因素范围，利用Design-Expert 8.0.6软件设计三因素三水平Box-Behnken响应面试验，并对结果进行分析，因素及水平见表1。

1.3.7 验证工艺

选取响应面试验得到的最优提取工艺，平行3组，计算丹酚酸B的质量，以确定丹酚酸B的最优提取工艺。

2 结果与分析

2.1 高效液相图谱

丹酚酸B标准品和供试品色谱图如图1和图2所示。

图1 丹酚酸B标准品图谱

图2 丹酚酸B供试品图谱

2.2 提取温度单因素试验结果

固定料液比1︰10（g/mL），提取时间60 min，考察提取温度60，70，80和

90 ℃对丹酚酸B的提取量影响。如图3所示，纵坐标为待测样品的峰面积。在80℃时有最大峰面积，即在相同条件下80 ℃提取的丹酚酸B量最多。

2.3 料液比单因素试验结果

固定提取温度80 ℃，提取60 min，提取1次，考察料液比1︰8，1︰10，1︰12，1︰15，1︰20，1︰40和1︰80 g/mL。如图4所示，料液比1︰15 g/mL时有最大值，当水量继续增加，提取含量呈下降趋势，到1︰40 g/mL之后，丹酚酸B含量基本不变。

图3 提取温度对丹酚酸B提取量的影响

图4 料液比对丹酚酸B提取量的影响

2.4 提取时间单因素试验结果

固定料液比1︰10 g/mL，提取温度80 ℃，考察提取时间20，30，60，90和120 min时的丹酚酸B提取量。如图5所示，纵坐标为供试品中丹酚酸B的峰面积，提取时间在20和30 min时，丹酚酸B的提取量最大，随着时间延长，丹酚酸B的提取量呈下降趋势。随着时间增加，丹酚酸B在水溶液中开始慢慢降解，这与其他研究得到的丹酚酸B降解理论一致，丹酚酸B的提取不能采用长时间加热。Y=27.24+1.26A-1.67B+3.62C-0.12AB+0.31AC+0.28BC-1.02A2-0.077B2-3.37C2。R2=0.986 9，R2adj=0.970 0。

图5 提取时间对丹酚酸B提取量的影响

表2 丹酚酸B提取工艺优化响应面试验设计及结果

从表3中的方差分析可知，模型p＜0.000 1，说明以响应值（丹酚酸B提取量）建立的回归模型极显著。相关系数R2=0.986 9，修正系数R2adj=0.970 0，表明模型的实测值与预测值吻合，失拟项p＞0.05，失拟项不显著，表明二元多项式对试验中的拟合较好。A、B、C、C2对试验结果影响极显著（p＜0.01），A2、B2对试验结果影响显著（p＜0.05）。

表3 模型回归方程方差分析

2.5 响应面试验

2.5.1 响应面试验设计

试验设计及相应数据见表2。经软件Design Expert 8.0.5分析，丹酚酸B提取量与料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）的二元多项式模型为

2.5.2 响应面图分析及优化

根据模型绘制出各因素的等高线和响应面，如图6～图8所示，两两因素绘制的影响面平缓，可知两两因素的交互作用不显著，这与回归方程分析给出的结果一致。

2.6 验证工艺

根据软件Design-Expert 8.0.5预测的丹酚酸B提取最佳工艺为料液比1∶19.04 g/mL，提取时间20 min，提取温度85.31 ℃。考虑到实际操作，各因素修正为：料液比1∶19 g/mL，提取时间20 min，提取温度85 ℃，平行3次试验，得到丹酚酸B提取量为29.12 mg/g与理论值29.57 mg/g接近。经响应面法优化的丹酚酸B提取工艺可行。

图6 提取时间和料液比对丹酚酸B提取量影响的等高线和响应面

图7 提取温度和料液比对丹酚酸B提取量影响的等高线和响应面

图8 提取温度和提取时间对丹酚酸B提取量影响的等高线和响应面

3 结论与讨论

单因素试验基础上，采用Box-Behnken响应面设计法优化丹酚酸B的提取工艺，结果表明，建立的二元多项回归方程拟合度好，该工艺稳定可行。在该工艺的试验过程中发现，提取温度对于试验的结果相比较其他因素影响更加明显。在对温度进行单因素试验时发现，较低温度时丹参提取液很难抽滤，检测出丹酚酸B含量较低。这与王萍等得到的结果一致[6]。刘佳妮等[7]在试验中指出，70 ℃之前丹参多糖含量逐渐增加，70 ℃之后开始减少。这可能是在较低温度下提取物含有大量多糖，使得溶液黏性增大，流动性差，导致丹酚酸B提取不充分。具体原因还需要更多试验数据来说明。通过该试验，为丹酚酸B的提取及更好的开发利用丹酚酸B提供试验数据。