花生中油酸与亚油酸含量测定方法研究

赵 星 ，张嘉楠 ，杨 华 ，王 瑾 ，宋亚辉 ，陈四龙 ，李玉荣

（1.河北省农林科学院粮油作物研究所 河北省作物遗传育种实验室，河北 石家庄 050035；2.石家庄学院 化工学院，河北 石家庄 050035；3.河北省农林科学院谷子研究所 国家谷子改良中心，河北 石家庄 050035）

0 引言

花生又名落花生、长生果，是全球最重要的四大油料作物之一，在世界油脂生产中具有举足轻重的地位.中国是世界最大的花生生产国，除西藏、青海外，其他省份均有种植，并以山东、河南、河北、广东、安徽等地的产量和种植面积最大.花生富含维生素、矿物质和多种生物活性物质，并含有多种对心脏有益的物质，例如不饱和脂肪酸、钾、镁、烟酸、甾醇、白藜芦醇、类黄酮等[1-3].长期以来，我国60%的花生用于榨油[4]，花生油气味醇香，深受人们喜爱，被誉为“中国的橄榄油”.脂肪酸的组成是决定花生油质量的重要因素，花生中的脂肪酸包括饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸的含量达85%以上，且以对心血管疾病有益的油酸与亚油酸为主[2，3，5].油酸具有降低高血脂症患者血脂水平以及预防心血管疾病的作用，而油酸/亚油酸（O/L）影响着油脂的氧化稳定性，即货架期，是决定花生油品质的重要因素[6].因此，对花生中的油酸与亚油酸进行定量分析，是进行花生原料品质评价的重要步骤.

本研究以花生仁为原料，采用超声波辅助提取法获得的正己烷提取液为样品溶液，以十七烷酸甲酯为内标，确定最佳气相条件，并进行方法学验证，为花生中油酸与亚油酸的含量测定建立专属性强、准确度高、重复性好、操作简便的气相分析方法.

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料

安捷伦6890N型气相色谱仪（配有FID检测器与气相色谱工作站，美国安捷伦公司）；SB-5200D型数控超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；AL204型电子天平购自梅特勒-托利多仪器有限公司；HHS-21.6型水浴锅购自山西省文水医疗器械厂；PICO21型离心机购自赛默飞世尔科技公司；Research型移液器购自德国Eppendorf公司.

正己烷（色谱纯，德国默克公司）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；十七烷酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯对照品均购自美国Sigma-Alorich公司；氢氧化钾为国产分析纯；去离子水由美国Milli-Q Academic纯水器制备.花生仁样品由河北省农林科学院粮油作物研究所花生组自采，采制日期为2013年10月.

1.2 溶液的制备

1.2.1 内标溶液的制备

取十七烷酸甲酯适量，精密称定，置50 mL的量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后得浓度为0.298 6 mg/mL的内标溶液，置4℃冰箱中保存，备用.

1.2.2 标准储备液的制备

取油酸甲酯与亚油酸甲酯适量，精密称定，分别置5 mL的量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为58.60 mg/mL和54.85 mg/mL的标准储备液，置4℃冰箱中保存，备用.

1.2.3 系列标准溶液的制备

精密量取油酸甲酯与亚油酸甲酯的标准储备液适量，置同一5 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为10.15 mg/mL和7.032 mg/mL的混合标准储备液；取混合标准储备液，以甲醇逐级稀释制成油酸甲酯（亚油酸甲酯）浓度分别为 10.15（7.032），5.074（3.516），2.029（1.406），1.015（0.703 2），0.5074（0.351 6），0.2029（0.140 6），0.101 5（0.070 32）mg/mL 的系列标准溶液，临用现配.

1.2.4 甲酯化试剂的制备

取氢氧化钾适量，加入少量水溶解，以甲醇稀释，配制成浓度为0.4 mol/L的KOH-甲醇溶液，室温放置24 h，即得.

1.3 油酸与亚油酸样品提取液的制备

取粉碎并烘干至恒重的花生仁样品0.1 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入正己烷1 mL，浸泡30 min后，于45℃下超声（功率250 W）提取20 min，冷却至室温，以正己烷稀释至刻度，摇匀，离心15 min（室温，14 000 r/min）后，上清液以正己烷稀释5倍，即得.

1.4 油酸甲酯与亚油酸甲酯供试溶液的制备

精密量取上述样品提取液250 μL、甲醇100 μL、内标溶液100 μL于2 mL离心管中，加入甲酯化试剂0.5 mL，混匀，于60℃水浴反应20 min，期间振荡混匀3次.反应结束后，冷却至室温，加入0.6 mL去离子水，摇匀，离心15 min（室温，14 000 r/min），分离正己烷层于200 μL离心管中，进行气相色谱分析.

1.5 气相色谱分析

色谱柱：Agilent DB-23 毛细管柱（0.25 μm×320 μm×30 m）；载气：氮气；升温程序：初始温度 140℃，以8℃/min升至220℃，保持3 min，然后以10℃/min上升到220℃，保持5 min；进样口及检测器温度：250℃；柱流量：0.7 mL/min；分流比：1∶20；进样量：2 μL.

1.6 数据处理

采用安捷伦6890N工作站计算内标、油酸甲酯、亚油酸甲酯色谱峰的保留时间（tR）、峰面积（A）、对称因子（T）、分离度（R）与理论塔板数（N），并将内标、油酸甲酯、亚油酸甲酯色谱峰面积分别代入公式（1）、（2），计算花生样品中油酸与亚油酸的含量.

式中（A油/A内）样，（A亚油/A内）样分别代表供试溶液中油酸甲酯、亚油酸甲酯与内标色谱峰面积的比值；（A油/A内）对，（A亚油/A内）对分别代表对照品中油酸甲酯、亚油酸甲酯与内标色谱峰面积的比值；c油，c亚油分别代表对照品溶液中油酸甲酯、亚油酸甲酯的浓度（单位：mg/mL）；V样为样品提取时所用量瓶的体积（单位：mL）；F油，F亚油分别代表油酸、亚油酸的校正系数，F油=1.905 4，F亚油=1.904 8；W样为样品提取时的称样量（单位：g）.

2 结果与讨论

2.1 系统适用性

精密吸取内标溶液、对照溶液和无内标的供试溶液各2 μL进样，记录色谱图（图1），内标物、油酸甲酯、亚油酸甲酯的保留时间分别为8.29，9.38，9.84 min，对称因子、各峰与相邻峰的分离度均符合气相色谱的定量要求[7]，理论板数按油酸甲酯峰计算不低于5 000，且内标物与样品中的各成分无交叉干扰.

精密吸取供试溶液2 μL，重复进样6次，记录色谱图，分别计算油酸甲酯、亚油酸甲酯与内标物峰的相对峰面积（A油/A内）、（A亚油/A内）的相对标准偏差（RSD）分别为1.43%和0.51%，色谱系统重复性符合定量要求[7].

2.2 线性与范围

精密量取系列标准溶液各100 μL，分别置于2 mL离心管中，以250 μL正己烷代替样品提取液，加入内标溶液100 μL，按1.4节的方法处理，照1.5节的色谱条件进样分析，记录色谱图.每个浓度3样本分析，分别以油酸甲酯与亚油酸甲酯质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），平均相对峰面积为纵坐标（Y），采用加权最小二乘法进行线性回归，权重系数以1/X2计算，所得的回归方程即为标准曲线.

按照上述方法计算，油酸甲酯、亚油酸甲酯的回归方程与相关系数（r）分别为：油酸甲酯：Y=4.210X-0.027，r=0.999 3（n=7）；亚油酸甲酯：Y=3.906X-0.042，r=0.999 3（n=7）.

结果表明，油酸甲酯、亚油酸甲酯分别在质量浓度0.101 5～10.15 mg/mL和0.070 32～7.032 mg/mL范围内呈良好的线性关系，在样品定量分析过程中，可采用“一点法”进行浓度计算，经推导得公式（1）和（2）.油酸甲酯、亚油酸甲酯混合标准溶液的推荐浓度分别为1 mg/mL与0.7 mg/mL.

图1 内标溶液、对照溶液和无内标物的供试溶液色谱图

2.3 重复性

2.3.1 衍生化反应重复性

取来源相同的样品提取液，按照1.4节的方法处理进行衍生化处理，平行6样本，进行气相色谱分析，记录峰面积，分别计算油酸甲酯与亚油酸甲酯相对峰面积的RSD，考察油酸与亚油酸衍生化反应的重复性.结果表明，油酸甲酯与亚油酸甲酯相对峰面积的RSD分别为4.33%和4.04%，衍生化反应重复性良好，可满足油酸与亚油酸的定量测定要求.

2.3.2 方法重复性

取来源相同的花生样品，按1.3节和1.4节的方法处理，平行6样本，进行气相色谱分析，记录峰面积，分别代入公式（1）、（2）计算油酸、亚油酸的含量及其RSD，考察方法的重复性.结果表明，花生样品中油酸与亚油酸6次测定结果的平均值分别为179.5 mg/g和150.6 mg/g，RSD分别为2.43%和2.11%，方法重复性良好.

2.4 回收率

取与2.3.2节来源相同的花生样品0.05 g，精密称定，置10 mL量瓶中，精密加入含油酸（亚油酸）17.98（15.06）mg/mL的溶液0.5 mL，按照1.3和1.4节的方法处理，平行6样本，进行气相色谱分析，记录峰面积，并按照公式（3）计算回收率：

结果表明，油酸、亚油酸的平均回收率分别为95.59%和97.42%，RSD分别为1.97%和2.11%，方法准确度高，能够满足花生中油酸、亚油酸定量分析的要求.

2.5 稳定性

2.5.1 油酸与亚油酸样品提取液的稳定性

取来源相同的花生样品3份，照1.3节的方法制备样品提取液，分别在室温下放置0，1，2，3，5 h后，按照1.4节方法处理，进行气相色谱分析，记录峰面积，分别计算各时间点相对峰面积与0 h相对峰面积的相对误差（RE），考察油酸与亚油酸样品提取液的稳定性.结果表明，室温下放置2 h以内，油酸、亚油酸的RE分别为-2.24～4.59%和-2.98～4.74%，放置3 h之后，个别样品中油酸、亚油酸的RE＞5.0%.由此可见，油酸与亚油酸样品提取液的稳定性较差，应临用现配，制备完成后应尽快进行衍生化，不宜长时间放置.

2.5.2 油酸与亚油酸甲酯供试溶液的稳定性

取新制备的3份衍生化溶液，分别在室温放置0，1，3，7，24，48 h后进样，记录峰面积，分别计算各时间点与0 h相对峰面积的RE，考察油酸甲酯与亚油酸甲酯供试溶液的稳定性.结果表明，室温下放置48 h，油酸甲酯、亚油酸甲酯的RE分别为-1.24～3.80%和-0.76～2.34%.由此可见，供试溶液于制备后48 h内稳定，在气相分析过程中，因放置时间与进样顺序不同而引入的误差可忽略不计.

2.6 讨论

2.6.1 衍生化方法的选择

本研究比较了三氟化硼法[8]与氢氧化钾-甲醇法对油酸与亚油酸甲酯化的衍生效果，发现三氟化硼的加入会使花生中油酸、亚油酸样品提取液在甲酯化过程中产生白色沉淀，且气相色谱图中油酸甲酯与亚油酸甲酯色谱峰响应降低，出现比采用氢氧化钾-甲醇法进行甲酯化更多的“本底峰”.因此，本研究采用操作简便、“本底峰”较少、毒性相对较低的氢氧化钾-甲醇法进行衍生化.考察了反应温度与时间对油酸与亚油酸甲酯化效率的影响，为了缩短反应时间，排除环境温度变化的影响，并且兼顾油酸与亚油酸样品提取液的稳定性，最终确定于60℃下反应20 min.

2.6.2 校正因子的应用

本研究以油酸甲酯与亚油酸甲酯为对照品，通过加校正因子对花生中的油酸、亚油酸的含量进行计算.因为在回收率的考察中，油酸、亚油酸对照品在实验过程中未表现出与花生样品所含油酸、亚油酸相同的甲酯化效率，且花生样品提取液甲酯化得到的油酸甲酯、亚油酸甲酯色谱峰在保留时间、对称因子、理论板数等方面，均与油酸甲酯、亚油酸甲酯对照品无统计学差异.推测产生这一现象的原因，可能是由于本研究测定总油酸与总亚油酸，而花生中的油酸、亚油酸存在多种顺、反异构体[9]，不同异构体在甲酯化效率上可能存在着差异.

2.6.3 定量方法的选择

在精密度验证中发现，直接以油酸与亚油酸甲酯峰面积计算含量时，RSD分别为6.47%和5.90%，不符合定量分析的要求，故本研究采用内标法，可有效控制甲酯衍生化过程和气相色谱分析进样误差，获得了满足定量分析要求的准确度和精密度.在稳定性试验过程中，发现由于正己烷的挥发性强，供试溶液放置48 h后可能出现溶液被浓缩或挥干现象，以正己烷稀释或复溶处理后，采用内标法计算，不影响油酸甲酯与亚油酸甲酯的定量结果.虽有文献[10]报道，花生中含有十七烷酸，然而在所选样品浓度范围内，花生中十七烷酸甲酯化后产生的色谱信号低于仪器的检测限（信噪比S/N＜3），在所选条件下，不产生色谱峰，对油酸、亚油酸定量分析的干扰可忽略不计.

3 结论

本研究以正己烷为提取溶剂，采用超声波辅助提取法制备样品提取液，氢氧化钾-甲醇法进行甲酯衍生化制备供试溶液，并以十七烷酸甲酯为内标，建立了花生中油酸与亚油酸含量测定的气相色谱方法.经方法学验证，本研究所建立的定量分析方法专属性强、灵敏度高、准确可靠、重现性好，且操作简便、耗时短、毒性小、检测费用低，适用于花生中油酸与亚油酸的常规定量分析，为花生原料品质的评价与质量的控制研究奠定了基础.