雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠酒精性损伤肾脏的保护作用研究

2019-05-23魏芬芬王文娟贺青华

生命科学研究 2019年2期

魏芬芬,王文娟,贺青华,张波

(北京联合大学健康与环境学院,中国北京100191)

过量饮酒仍然是当今世界一个严重威胁人类健康的问题,酒精及其代谢产物能够引起脂质代谢紊乱、氧化应激及细胞凋亡等,对多种器官造成损伤,如胃、肝脏和肾脏等[1～2]。Yuan 等[3]的研究证实,肾脏中同样存在代谢乙醇的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶,同样可实现对乙醇的代谢,其代谢途径和方式可能与肝脏相似,并最终将代谢产物排出体内。因此,可以推断,肾脏在代谢和排泄酒精时,可能也会受到一定的氧化损伤和发生炎症反应,从而对肾脏细胞造成一定损伤[4～6]。目前国内外对酒精性肝损伤已存在大量实验研究,而酒精对肾脏的损伤研究则相对较少。

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞绿藻,因其在孢子形成过程中会积累大量的类胡萝卜素,主要为虾青素,因此被称为天然虾青素的“浓缩品”,而虾青素也是雨生红球藻主要的活性物质[7～9]。雨生红球藻被认为是虾青素最好的来源之一,在2009年被列为新资源食品,因此关于雨生红球藻的活性功能研究也受到广泛关注。黄浦俊等[10]比较了破壁与未破壁雨生红球藻粉的抗氧化能力,发现无论是破壁还是未破壁的雨生红球藻粉都具有较强的抗氧化能力,但破壁雨生红球藻粉的抗氧化能力更强。刘颖芬等[11]发现雨生红球藻来源的虾青素具有增强小鼠免疫力的功能。李勇超等[12]研究发现雨生红球藻破壁孢子粉能够缓解小鼠高血糖模型的氧化损伤和炎症反应,提高小鼠肝、肾的抗氧化能力。本研究拟通过建立酒精性损伤小鼠模型,研究酒精对小鼠肾脏的损伤作用以及雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性损伤肾脏的保护作用,旨在为雨生红球藻的开发利用提供一定的理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

60只SPF级雄性昆明小鼠(维通利华实验动物有限公司)的体质量为(25±2)g,动物许可证编号:SCXK(京)2012-0001。实验小鼠在北京联合大学应用文理学院功能食品检测中心的SPF级屏障系统中饲养,动物方许可证号:SYXK(京)2012-0031。饲养条件如下:温度控制在(20±2)℃,空气相对湿度50%～70%,光照周期为14 h光照(6:00～20:00)/10 h黑暗,自由取食、饮水。

1.1.2 主要仪器与试剂

雨生红球藻破壁孢子粉(杭州鑫伟低碳技术研发有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(南京建成生物工程研究所);小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)酶联反应测定试剂盒(上海沪尚生物科技有限公司)。UV-2450紫外可见分光光度计(日本津岛仪器有限公司);5804R型低温高速离心机(德国Eppendorf股份公司);7180型全自动生化分析仪(日本日立高新技术公司);电动匀浆器(常州朗越仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠酒精性损伤模型的建立

60只昆明小鼠适应性喂养5 d后,将其随机分为正常对照组、模型组、雨生红球藻破壁孢子粉低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(400 mg/kg)剂量组,共5组,每组12只。雨生红球藻破壁孢子粉各剂量按照新资源食品对雨生红球藻的人体推荐量(0.8 g/d)进行设置,受试物采用双蒸水进行配制。对照组与模型组小鼠初始体质量无明显差异,对本实验结果无影响。各剂量组每天经口灌胃受试物(20 mL/kg),正常对照组和模型组则给予等体积双蒸水。从实验第8天开始,各剂量组先给予受试物,4 h后各剂量组和模型组再分别给予50%酒精,正常对照组则给与等体积双蒸水,连续7 d。本次实验所使用的造模方法已经过多次预实验,预实验结果表明:连续灌胃小鼠50%酒精一周,造模效果较好,既能保证造模的成功,也能保证小鼠死亡概率最小,因此我们在正式实验中采用了此种造模方式。

1.2.2 血清及脏器的采集与制备

末次灌胃后,各组小鼠断食不断水16 h。随后称重并摘眼球取血。血液静置30 min后,于4 000 r/min室温离心15 min,分离血清置于1.5 mL离心管中,4℃保存。同时,对颈椎脱臼处死后的小鼠进行解剖,取肾脏,并迅速用预冷的体积分数为0.9%的生理盐水冲净脏器表面浮血,滤纸拭干,称重,迅速放于液氮中,最后转移至-80℃冰箱待下一步实验使用。

1.2.3 实验动物肾脏指数的计算

解剖取得小鼠两颗肾脏后,迅速用预冷的体积分数为0.9%的生理盐水冲净表面浮血,滤纸拭干,称重。按照如下公式计算实验小鼠的肾脏指数:肾脏指数(%)=小鼠肾脏质量(g)/小鼠体质量(g)×100%。

（3）表面活性剂的吸附浓度随着表面活性剂浓度的增加而逐渐增大。吸附浓度的增加使得采出程度和含水率降幅都有十分明显的增加，表面活性剂吸附作用对驱油效果影响较大，在无碱二元驱过程中应该重点考虑表面活性剂的吸附作用。

1.2.4 血清生化指标的检测

采用全自动生化分析仪测定血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)以及肌酐(creatinine,CREA)的浓度。

1.2.5 肾脏组织氧化指标检测

将肾脏从-80℃冰箱取出,与0.9%生理盐水按照1∶9的比例混合,进行组织匀浆,匀浆后成为10%的肾脏匀浆液,待用。取匀浆好的10%肾脏组织匀浆液,分别测定肾脏组织中SOD的活性以及GSH和MDA的含量,检测过程严格按照南京建成生物工程研究所相关试剂盒说明书进行操作。SOD检测为每mg蛋白质中SOD的活力,单位为U/(mg prot),GSH检测为每mg蛋白质中GSH含量,单位为mg GSH/(mg prot),MDA检测为每mg蛋白质中MDA的含量,单位为nmol/(mg prot)。

1.2.6 炎性因子检测

取上述匀浆好的10%的肾脏组织匀浆液,用ELISA试剂盒测定肾脏组织中TNF-α和IL-1β的浓度。检测操作严格按照上海沪尚生物科技有限公司相关试剂盒说明书进行。

采用SPSS 22软件对实验数据进行统计分析,实验结果以平均值±标准差(±s)表示,显著性检验采用单因素方差分析。图片处理采用OriginPro 2017软件。

2 结果

2.1 雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性损伤小鼠体质量及肾脏指数的影响

为了检验酒精对实验动物肾脏的损伤程度,我们先计算了动物的肾脏指数。由表1可知,与正常对照组相比,模型组体质量显著下降(P＜0.01),肾脏质量显著增加(P＜0.05),肾脏指数显著上升(P＜0.01),表明小鼠在经大量酒精连续刺激后,食欲受到影响,基础代谢率可能降低,从而导致体质量下降,也正是因为肾脏受到酒精的刺激,可能发生了肿胀或者炎症,导致肾脏质量增加,肾脏指数增加。与模型组相比,各剂量组小鼠的体质量增加,肾脏指数下降,但在本实验期间还未表现出显著性差异,表明雨生红球藻对酒精性的肾脏损伤有一定保护,但这种保护作用可能还需要更长的周期才能表现出显著性差异。

2.2 雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性损伤小鼠血清BUN以及CREA的影响

为了进一步评价肾脏功能,我们检测了血清中BUN以及CREA的浓度。结果如表2所示,与正常对照组相比,模型组小鼠血清BUN和CREA的浓度均显著升高(P＜0.01),表明模型组小鼠在酒精刺激下,肾脏功能受到一定损伤,从而导致血清中BUN和CREA浓度的异常。与模型组相比,各剂量组BUN和CREA的浓度均有所下降,中剂量组和高剂量组的BUN浓度显著降低(P＜0.05),CREA浓度则在低剂量组和高剂量组中均显著降低(P＜0.05),表明在雨生红球藻的干预下,肾脏损伤程度得到一定的缓解。

2.3 雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性损伤小鼠肾脏SOD、GSH、MDA的影响

为了探究酒精对实验小鼠肾脏的氧化损伤情况,我们检测了肾脏匀浆液中SOD活性以及GSH、MDA含量的变化。由表3可知,与正常对照组相比,模型组小鼠的SOD活性、GSH含量均显著降低(P＜0.01),同时MDA含量显著升高(P＜0.01),表明模型组小鼠经酒精刺激后,肾脏发生了氧化损伤,导致抗氧化酶活性及含量明显降低,同时脂质过氧化物增多。与模型组相比,各剂量组的SOD活性和GSH含量显著升高(P＜0.05),而MDA含量则显著下降(P＜0.05),表明雨生红球藻可以提高酒精性损伤小鼠肾脏的抗氧化能力,减少脂质过氧化物的产生。

表1 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠体质量及肾脏指数的影响Table 1 Effects of H.pluvialis on weight and kidney index of mice

表2 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠血清BUN以及CREA的影响Table 2 Effects of H.pluvialis on BUN and CREA in sera of mice

2.4 雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性损伤小鼠肾脏IL-1β和TNF-α的影响

进一步对实验小鼠的炎症反应进行研究,检测结果见表4。与正常对照组相比,模型组小鼠的IL-1β、TNF-α 含量均显著升高(P＜0.01),表明模型组小鼠经酒精刺激后,肾脏发生了炎症反应,并导致炎性因子质量浓度增加。与模型组相比,各剂量组小鼠的IL-1β、TNF-α含量均呈下降趋势,其中,中剂量组的IL-1β显著下降(P＜0.05),中剂量组和高剂量组的TNF-α均极显著降低(P＜0.01),表明剂量组小鼠在雨生红球藻的干预下,炎症损伤减轻。

3 讨论

雨生红球藻具有抗炎、免疫调节以及抗氧化等活性功能[12～13]。本课题组之前研究表明,雨生红球藻破壁孢子粉对酒精性肝损伤小鼠具有保护作用[14]。酒精对脏器的损害主要是由于其代谢产物乙醛引起机体的代谢紊乱及炎症反应[15～16],肝脏则是酒精危害最大的一个器官。有研究表明,肾脏也同时负责10%的酒精代谢与排泄[3]。鲁政等[6]的研究提示酒精能够显著引起肾脏的氧化损伤。本课题组通过连续酒精灌胃小鼠7 d,建立酒精性损伤模型,实验结果表明,模型组小鼠肝脏出现病理改变,血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平升高,提示建模成功[14]。

表4 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠肾脏IL-1β和TNF-α的影响Table 4 Effects of H.pluvialis on IL-1β and TNF-α in kidneys of mice

表3 雨生红球藻破壁孢子粉对小鼠肾脏SOD、GSH、MDA的影响Table 3 Effects of H.pluvialis on SOD,GSH and MDA in kidneys of mice

脏器指数是评估脏器受损的一个重要指标,当脏器指数升高时,说明脏器受损,可能发生肿胀或者炎症反应[17]。本实验结果显示,实验小鼠在连续灌胃50%酒精7 d后,与正常对照组相比,肾脏指数升高了33.33%,具有统计学差异(P＜0.01,表1),表明模型组小鼠肾脏受到酒精刺激,发生了损伤。而各剂量组与模型组相比,肾脏指数均呈下降趋势,但在本次实验中未表现出显著性差异(表1),提示雨生红球藻虽对肾脏有一定保护作用,但是这一作用的发生需要一定的时间才能具有统计学意义。血清尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)是临床上评价肾功能的重要指标,当血清中BUN和CREA浓度升高时,则表明肾功能可能出现异常[18]。当机体摄入过量酒精时,10%左右的酒精在肾脏中进行代谢和排泄,从而产生自由基,发生脂质过氧化反应和炎症反应[6]。本实验中,模型组小鼠的BUN和CREA浓度显著高于正常对照组(表2),提示酒精可能造成了小鼠的肾功能损伤,如肾小管的重吸收能力下降,肾小球滤过功能降低[19]。这与王楠等[20]的研究结果一致,即酒精可以对肾功能造成损伤。而各剂量组与模型组相比,血清中BUN和CREA浓度均下降(表2)。本实验结果表明,雨生红球藻破壁孢子粉能够在一定程度上减轻酒精对小鼠肾功能的损害作用。SOD是机体内清除自由基的重要物质,其在体内的水平可以作为细胞衰老和死亡的直观指示[21]。GSH能直接催化脂质还原和过氧化氢,减轻自由基带来的损伤,是细胞抵抗氧化损害的主要物质[22]。MDA作为脂质过氧化产物,是衡量机体脂质过氧化程度的重要指标[23]。在本实验中,与对照组相比,模型组小鼠SOD和GSH显著降低,且MDA含量显著升高(表3),表明酒精的长期摄入刺激肾脏产生的自由基增多,造成了氧化损伤,使机体抗氧化能力降低。与模型组相比,各剂量组的SOD与GSH均显著上升,MDA则显著下降,表明雨生红球藻破壁孢子粉能够增强小鼠的抗氧化能力,减少脂质过氧化物的产生,降低自由基对机体的攻击。王潮岗等[24]的实验表明雨生红球藻具有良好的抗氧化能力,对清除自由基有很好的效果,这与本实验的结果一致。酒精以及代谢产物刺激也能导致机体发生炎症反应,使得一些致炎因子如IL-1β和TNF-α的浓度升高,对机体造成炎症损伤[25]。在本实验中,与正常对照组相比,模型组小鼠的IL-1β和TNF-α均显著升高(表4),表明由于酒精的刺激,小鼠体内发生了炎症损伤,产生了致炎因子。而各剂量组与模型组相比,IL-1β和TNF-α均呈下降趋势(表4),表明雨生红球藻破壁孢子粉在一定程度上能减轻小鼠的炎症反应。