血清PIVKA-Ⅱ与AFP检测在原发性肝细胞癌诊断中的应用

侯 帅,欧阳锡武,李荣华,傅 蕾,符小玉,郑宜翔,彭仕芳*

(中南大学湘雅医院a.感染病科和病毒性肝炎湖南省重点实验室;b.肝脏外科;c.核医学科,中国湖南长沙410008)

原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)是中国最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居恶性肿瘤的第二位[1]。因缺乏高效的早期诊断方法,原发性肝癌往往确诊时已经是晚期阶段,不能进行根治性治疗,导致其预后差,死亡率高。目前,乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染导致的原发性肝癌占80%[2],为中国原发性肝癌的主要病因。维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导的蛋白质又称异常凝血酶原Ⅱ(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ),是近年来新应用于临床筛查原发性肝癌的肿瘤标志物[3],其特异性较高[4],在甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)阴性的肝癌患者中也会升高[5]。相关研究表明PIVKA-Ⅱ在乙型肝炎病毒相关性原发性肝细胞癌中的阳性率更高[6]。此外,有研究报道AFP与PIVKA-Ⅱ的产生及其表达量是相对独立的[7],而且血清AFP与PIVKA-Ⅱ在检测肝癌过程中无相关性,理论上可以将两者联合检测以增加原发性肝癌诊断的敏感性[8]。基于已有的研究报道,本研究拟探讨血清PIVKA-Ⅱ相对于AFP在原发性肝细胞癌检测中的优势及PIVKA-Ⅱ诊断肝细胞癌的最佳cut-off值及其影响因素。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集来自中南大学湘雅医院2016年9月至2017年6月住院患者及门诊患者的血清237例,其中乙型肝炎相关性原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者115例,乙肝携带者(asymptomatic carrier,AsC)55例,乙型肝炎相关肝硬化(liver cirrhosis,LC)患者47例,非肝癌肿瘤患者20例。HCC患者的血清标本要求是来源于病理学或临床诊断为乙型肝炎病毒相关性原发性肝细胞癌的住院患者(未使用华法林和维生素K1)。HCC的诊断符合《原发性肝癌诊疗规范》(2011年版),并按照TNM分期将患者分为早期肝癌(TNM-Ⅰ/Ⅱ)47例和晚期肝癌(TNM-Ⅲ/Ⅳ)68例。乙肝携带者为血清HBsAg阳性,HBV DNA低于检测下限,并且肝功能正常。乙肝病毒相关肝硬化患者:影像学提示肝硬化,但是无任何症状和体征,肝功能正常,血清HBsAg阳性,处于肝硬化代偿期。非肝癌肿瘤组为临床确诊的恶性肿瘤(非原发性肝癌)。

1.2 检测方法

全部标本在患者做相关检测时采集,血清保存在-80℃冰箱。血清AFP检测采用Roche cobas 6000全自动电化学免疫分析仪及其配套试剂;血清PIVKA-Ⅱ检测采用Abbott ARCHITECT i200SR全自动电化学免疫分析仪及其配套试剂。所有操作严格按照仪器和试剂使用说明书进行,试剂盒附带的高、低值质控品的测定值均在要求范围内。诊断标准:AFP≥20 ng/mL为阳性,PIVKA-Ⅱ≥40 mAU/mL为阳性。

1.3 统计学处理

应用SPSS 25和MedCalc软件对数据进行分析。对AFP、PIVKA-Ⅱ两组数据分布进行正态性检验,P＜0.05,属于非正态分布,因此用中位数和四分位数间距［M(X25%,X75%)］表示,组间比较用秩和检验(Mann-Whitney U检验),率的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法,ROC曲线下面积比较采用Z检验。应用受试者操作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC curve)分析AFP和PIVKA-Ⅱ诊断肝细胞癌的效能,并确定其cut-off值。统计分析均采用双侧检验,P＜0.05为差异有统计学意义。使用logistic回归分析生成AFP+PIVKA-Ⅱ联合的新变量combination,以灵敏度为纵坐标,1-特异度为横坐标制作ROC曲线,计算ROC曲线下面积。采用logistic回归分析PIVKA-Ⅱ≥40、PIVKA-Ⅱ＜40两组患者之间的差异性指标(性别、年龄、病毒载量、肿瘤分期、癌结节数目、肿块直径、是否抗病毒治疗)与PIVKA-Ⅱ检测结果的关系。临床指标组间比较采用非参数检验Kruskal-Wallis H检验。图表制作分别使用 Excel、SPSS 25、GraghPad 软件。

2 结果

2.1 AFP、PIVKA-Ⅱ在各组血清中的表达情况

所有患者血清中AFP、PIVKA-Ⅱ的表达情况见表1、图1。HCC组AFP、PIVKA-Ⅱ的表达量显著高于对照组(AsC组、LC组、非肝癌肿瘤组)。其中,早期肝癌组(Ⅰ、Ⅱ期)患者和晚期肝癌组(Ⅲ、Ⅳ期)患者血清中AFP、PIVKA-Ⅱ的中位表达量均显著高于非肝癌组(包括AsC组、LC组和非肝癌肿瘤组),差异有统计学意义(P＜0.05)。此外,晚期肝癌患者血清中PIVKA-Ⅱ的中位表达量高于早期肝癌患者,差异亦具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 血清PIVKA-Ⅱ、AFP检测和AFP与PIVKA-Ⅱ联合检测诊断原发性肝细胞癌的效率

以AsC组、LC组和非肝癌肿瘤组为对照,分别绘制AFP、PIVKA-Ⅱ的ROC曲线(图2),得到对应的ROC曲线下面积分别为0.881(95%CI 0.834～0.927,P＜0.001)、0.945(95%CI 0.918～0.972,P＜0.001),表明两者均有较高的诊断意义。此外,PIVKA-Ⅱ的ROC曲线下面积大于AFP的ROC曲线下面积(P=0.009),提示PIVKA-Ⅱ对肝细胞癌的检测效能优于AFP。进一步将两者联合进行检测(AFP+PIVKA-Ⅱ),联合检测的定义为PIVKA-Ⅱ和AFP只要有一项检测为阳性即判断联合检测为阳性。使用logistic回归分析,生成AFP+PIVKA-Ⅱ联合检测的新变量combination,根据其绘制ROC曲线,对应的ROC曲线下面积为0.962(95%CI 0.940～0.983,P＜0.001),大于AFP的ROC曲线下面积(P＜0.001),但与PIVKA-Ⅱ的ROC曲线下面积比较差异无统计学意义(P=0.085),表明AFP+PIVKA-Ⅱ检测肝细胞癌的效率优于AFP。

表1 不同血清组AFP、PIVKA-Ⅱ的表达量Table 1 Serum levels of AFP and PIVKA-Ⅱamong those with early-stage HCC,advanced-stage HCC,AsC,LC and other carcinomas

图1 不同血清标本中AFP与PIVKA-Ⅱ的表达量分析Fig.1 Serum AFP and PIVKA-II expression in early-stage HCC,advanced-stage HCC,AsC,LC and other carcinoma groups

由表2可知,以AsC组和LC组为对照时,AFP、PIVKA-Ⅱ和AFP+PIVKA-Ⅱ检测肝细胞癌的灵敏度分别为67.8%、81.7%和90.4%,AFP+PIVKA-Ⅱ和PIVKA-Ⅱ检测肝细胞癌的灵敏度较AFP检测高。为了进一步探究PIVKA-II、AFP检测鉴别原发性肝细胞癌与非肝癌肿瘤的能力,以非肝癌肿瘤组为对照,分析AFP、PIVKA-Ⅱ和AFP+PIVKA-Ⅱ检测原发性肝细胞癌的特异度。由表3可知,AFP、PIVKA-Ⅱ和 AFP+PIVKA-Ⅱ检测肝细胞癌的特异度分别为100%、80%和80%,提示AFP+PIVKA-Ⅱ和PIVKA-Ⅱ在原发性肝细胞癌检测中仍有较高的特异度。

图2 AFP、PIVKA-Ⅱ检测和AFP+PIVKA-Ⅱ联合检测的ROC曲线Fig.2 ROC curve of AFP,PIVKA-II and their combination

表2 以AsC组和LC组为对照时AFP、PIVKA-Ⅱ检测和联合检测的灵敏度与特异度Table 2 The sensitivity and specificity of AFP,PIVKA-Ⅱalone and in combination for diagnosis of HCC,compared with the AsC and the LC groups

表3 以非肝癌肿瘤组为对照时AFP、PIVKA-Ⅱ检测和联合检测的灵敏度与特异度Table 3 The sensitivity and specificity of AFP,PIVKA-Ⅱalone and in combination for diagnosis of HCC,compared with the non-hepatoma malignant tumor group

2.3 PIVKA-Ⅱ诊断原发性肝细胞癌的最佳临界点及其影响因素

以AsC组、LC组和非肝癌肿瘤组为对照,根据PIVKA-Ⅱ的ROC曲线,取约登指数(Youden index,灵敏度+特异度-1)最大的点为最佳临界点(cut-off值)。文中通过计算得出PIVKA-Ⅱ的最佳cut-off值为32 mAU/mL,应用此cut-off值,PIVKA-Ⅱ诊断肝细胞癌的灵敏度为86.1%,特异度为89.3%。

为进一步确定影响PIVKA-Ⅱ检测肝细胞癌的临床因素,根据PIVKA-Ⅱ的cut-off值是否≥40 mAU/mL[7,9]将HCC患者分为PIVKA-Ⅱ≥40组、PIVKA-Ⅱ＜40组,对两组患者的性别、年龄、病毒载量、肿瘤分期、癌结节数目、肿块直径、是否抗病毒治疗进行比较,同时采用logistic回归分析两组患者的差异性指标。结果显示:两组患者病毒载量[(706 555±2 340 350)IU/mL vs.(24 448±57 716)IU/mL,U=586.5,P=0.03]的差异具有统计学意义(表4)。病毒载量[OR=1.150,95%CI(1.022,1.295),P=0.02]为影响PIVKA-Ⅱ检测肝细胞癌的混杂因素(表5)。

前文计算得出PIVKA-Ⅱ的最佳cut-off值为32 mAU/mL,因此根据 PIVKA-Ⅱ的 cut-off值是否≥32 mAU/mL将HCC患者分为PIVKA-Ⅱ≥32组、PIVKA-Ⅱ＜32组,同样对两组患者的性别、年龄、病毒载量、肿瘤分期、癌结节数目、肿块直径、是否抗病毒治疗进行比较,并采用logistic回归分析两组患者的差异性指标。通过回归分析7个指标与肝细胞癌患者PIVKA-Ⅱ cut-off值是否≥32的关系发现,上述差异性指标均不是影响PIVKA-Ⅱ检测肝细胞癌的混杂因素。以上结果表明,相对于cut-off值为40 mAU/mL,PIVKA-Ⅱ的cut-off值为32 mAU/mL时其检测肝细胞癌不受乙肝病毒载量的干扰。

2.4 PIVKA-Ⅱ、AFP检测与临床指标的关系

根据PIVKA-Ⅱ与AFP的cut-off值分析临床指标与两者的关系,首先对肝癌患者进行如下分组:PIVKA-Ⅱ＜32 且 AFP＜20组、PIVKA-Ⅱ≥32且 AFP＜20组、PIVKA-Ⅱ＜32且 AFP≥20组、PIVKA-Ⅱ≥32且AFP≥20组,然后采用非参数检验Kruskal-Wallis H检验分析上述各组之间临床指标 ALB(albumin)、TBIL(total bilirubin)、ALT(alanine amino transferase)、INR(international normalized ratio)、肿块直径的差异。结果显示肿块直径的差异具有统计学意义(表6)。进一步两两比较各组的肿块直径得出:PIVKA-Ⅱ≥32且AFP＜20组的直径大于PIVKA-Ⅱ＜32且AFP≥20组(P=0.035)(图3)。上述结果说明PIVKA-Ⅱ表达量能反映肝细胞癌肿块的直径。同时探究HCC组患者PIVKA-Ⅱ表达量与肿块直径的相关关系,两者呈直线相关,Spearman相关系数为0.514,呈正相关,表明肿块直径越大,PIVKA-Ⅱ的表达量越高。

3 讨论

表4 PIVKA-Ⅱ检测诊断肝细胞癌的影响因素的单因素分析结果Table 4 Results of univariate analysis of influencing factors in diagnosis of HCC by PIVKA-II

表5 PIVKA-Ⅱ检测诊断肝细胞癌的影响因素的logistic回归分析结果Table 5 Results of multivariate logistic regression analysis of influencing factors in diagnosis of HCC by PIVKA-II

表6 不同组临床指标的比较Table 6 Comparison of clinical parameters in different groups

中国是肝癌大国,每年新发病例及死亡病例占全球50%以上,其中绝大部分是乙肝相关性肝癌。慢性HBV感染是HCC发生的高危因素,其发病率约是非HBV感染患者的200倍[10]。因此,HBV感染人群是HCC筛查的重点人群。2002年日本对HBV/HCV感染患者进行了肝癌筛查,超过60%的早期肝癌被检测出来[11];而中国的肝癌患者中,50%以上的患者在诊断时已经处于巴塞罗那分期C期,即晚期肝癌,五年生存率不足20%。可见筛查和早诊早治是显著降低肝癌死亡率的重要手段[12～13]。

图3 根据PIVKA-Ⅱ(32 mAU/mL)和AFP(20 ng/mL)的临界值将HCC患者分组,比较不同组的肿瘤直径Fig.3 Comparision of the diameter of tumor mass in different groups of HCC according to cut-off values of PIVKA-Ⅱ(32 mAU/mL)and AFP(20 ng/mL)

目前,用于临床筛查原发性肝癌的血清学标志物有AFP和PIVKA-Ⅱ。但AFP假阳性率高,无法明确鉴别HCC与良性肝病,易造成误诊。以10～20 ng/mL为截断值,AFP诊断HCC的灵敏度仅为40%～60%[8,14～15],部分HCC患者AFP阴性[5],有一定漏诊风险,这使AFP在HCC早期筛查和诊断方面存在局限性。PIVKA-Ⅱ是一种已被证实的致癌因子,在诊断早期HCC方面的灵敏度(77%)和特异度(82%)均较高[16],在诊断AFP阴性HCC患者时起互补作用,可降低漏检率,提高综合筛查效能。诊断界值的确定直接影响筛查效能,不同的人群及疾病状态、用药情况等均可能影响血清中PIVKA-Ⅱ的水平。已有研究显示在HBV感染人群中,AFP受到影响,诊断界值需要调整[17],提示HBV感染不仅仅是高危筛查的对象,作为宿主感染因素,抗病毒治疗以及免疫功能均可能对血清PIVKA-Ⅱ检测产生影响。因此,有必要对乙肝相关性肝癌人群进行深入研究,明确PIVKA-Ⅱ最佳的诊断界值,提高筛查效能及临床应用。

本研究对115例乙型肝炎病毒相关性原发性肝细胞癌患者和122例非肝癌患者的血液标本进行了PIVKA-Ⅱ和AFP的检测。在充分考虑到病程进展和肿瘤特征的混杂影响的基础上,我们在对照组中纳入AsC 55例、乙肝相关LC 47例及非肝癌肿瘤20例。在整体比较中,HCC组PIVKA-Ⅱ的表达量显著高于非肝癌组,差异均有统计学意义(P＜0.05),表明PIVKA-Ⅱ是原发性肝细胞癌的重要生物标志物,在乙肝人群中可以作为筛查原发性肝细胞癌的高效工具。为了进一步明确PIVKA-Ⅱ目前的诊断效能,以常规诊断界值即PIVKA-Ⅱ、AFP cut-off值分别为 40 mAU/mL、20 ng/mL对两者进行评价,结果显示:AFP、PIVKA-Ⅱ单独检测和AFP+PIVKA-Ⅱ联合检测对应的ROC曲线下面积分别为 0.881、0.945和0.962,表明PIVKA-Ⅱ和AFP+PIVKA-Ⅱ的诊断效能明显优于AFP(P＜0.05),PIVKA-Ⅱ在既往肝癌筛查中表现出的优异的诊断效能,在乙肝人群中同样适用。我们的研究结果表明PIVKA-Ⅱ在鉴别肝癌与慢性良性肝脏疾病方面优于AFP,与已有同行研究结果[8,14～15]相符。考虑到肝脏病变进展程度及炎性反应可能对AFP有潜在影响,为了验证HBV感染导致肝硬化进展程度是否也会导致PIVKA-Ⅱ的变化,影响其灵敏度,我们以AsC组+LC组为对照组进行分析,发现AFP、PIVKA-Ⅱ和AFP+PIVKA-Ⅱ检测诊断肝细胞癌的灵敏度分别为67.8%、81.7%和90.4%,提示PIVKA-Ⅱ、AFP+PIVKA-Ⅱ检测诊断肝细胞癌较AFP更灵敏,在一定程度上可以避免AFP阴性肝细胞癌的漏诊以及肝硬化、活动性肝炎相关的AFP假阳性导致的误诊。因此对于已发生肝硬化的乙肝人群,仅以AFP进行筛查,漏诊较大,联合PIVKA-Ⅱ检测可以显著减少这种风险(22.6%)。为了明确PIVKA-Ⅱ检测在原发性肝细胞癌与其他非肝癌肿瘤中的特异性,以非肝癌肿瘤组为对照组进行分析,结果显示AFP、PIVKA-Ⅱ和AFP+PIVKA-Ⅱ检测诊断原发性肝细胞癌的特异度分别为100%、80%和80%,提示其他肿瘤对PIVKA-Ⅱ检测的特异性影响较小,因此在进行肝癌筛查时,可联合AFP和PIVKA-Ⅱ进行检测,这样既可提高肝细胞癌的检出率同时又能有效鉴别其他肿瘤。若AFP阳性患者确实没有肝癌的进一步证据,可联合PIVKA-Ⅱ检测以协助排查肝细胞癌,同时需要警惕发生其他肿瘤的可能。综上可见,PIVKA-Ⅱ检测既能够灵敏地诊断肝细胞癌,又不会受HBV感染导致的肝脏疾病进展的影响,具有较高的特异性。在乙肝人群中利用PIVKA-Ⅱ进行肝癌筛查是可行的。

为了提高AFP和PIVKA-Ⅱ在乙肝人群中HCC的诊断效能,探索其与肝癌肿瘤特性的相关性,本研究以乙肝相关性原发性肝细胞癌患者为研究对象,提出PIVKA-Ⅱ最佳的诊断界值,深入分析其影响因素,为临床实践提出适用方案。我们采用logistic回归分析HCC患者的临床指标,结果表明:如果根据目前推荐的PIVKA-Ⅱ的诊断界值40 mAU/mL对乙肝患者进行肝细胞癌筛查,可能存在一定缺陷,其会受到乙肝病毒载量的影响,从而降低诊断效能。然而,如果根据本研究得出的PIVKA-Ⅱ最佳cut-off值32 mAU/mL对乙肝患者进行肝细胞癌筛查,不仅不会受到被检者乙肝病毒载量的影响,同时其灵敏度可达86.1%,较以往相关研究[6,8～9,14～15]提高了 5%～10%。因此,我们认为PIVKA-Ⅱ在乙肝人群中检测肝细胞癌的最佳cut-off值为32 mAU/mL。

相关文献报道:PIVKA-Ⅱ在原发性肝癌患者血清中升高可先于影像学发现[18];它在血清中的表达量随着肝细胞癌的进展而升高,一定程度上可以反映肝细胞癌的进程[3];此外,PIVKA-Ⅱ不仅可作为肝细胞癌微血管侵犯、肝细胞癌复发的预测因子,而且可作为指导诊疗策略制定的评估因素[3]。我们的研究结果表明PIVKA-Ⅱ与肝癌肿块直径的大小呈正相关,进一步证实PIVKA-Ⅱ可以作为肝癌肿瘤学特征变化的重要参考依据,提示可以根据PIVKA-Ⅱ的动态变化趋势来评估肝细胞癌治疗反应、预后和复发风险。

综上所述,PIVKA-Ⅱ在乙肝人群中的原发性肝细胞癌筛查效能得到充分验证,灵敏度及特异度均表现优异,联合AFP可以提高综合诊断能力。同时,本研究首次发现,乙肝人群中,PIVKA-Ⅱ作为原发性肝细胞癌筛查的最佳诊断界值为32 mAU/mL。此外,本研究进一步探讨了肝细胞癌治疗后PIVKA-Ⅱ的潜在应用价值。肝细胞癌三级预防的目标就是减少复发,延长生存时间,我们的分析结果提示在治疗后的随访过程中监测PIVKA-Ⅱ,有利于尽早发现肿瘤复发,提高生存率。