卵巢癌组织HMGN5基因表达与临床病理特征关系分析

张 洁 张培先 龙 轶 王 以

昆明医科大学附属延安医院（650051）

卵巢癌是女性最常见的三大恶性肿瘤之一，由于缺乏有效的早期诊断方法，超过50%的卵巢癌患者确诊时已为肿瘤晚期，多数伴随远处器官转移。国内外临床资料表明，卵巢癌患者五年生存率低于50%，且复发率非常高（80%）［1－3］。卵巢癌病因目前尚不十分清楚，其发病可能与年龄、生育、血型、精神，环境及遗传等因素有关。本研究分析HMGN5基因在卵巢癌中的表达变化及与患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 研究资料

收集2008年1月－2012年12月本院手术切除的卵巢癌标本120例，年龄（50.8±10.5）岁（20～81岁）；患者均经过病理、影像和临床诊断为原发性卵巢癌。根据WHO标准分型方法进行组织学分型：浆液性腺癌68例，黏液性腺癌30例，其他类22例。按WHO标准TNM分期进行临床分期：I期21例，II期47例，III期49例和IV期3例。按解剖位置分为左侧卵巢癌38例，右侧卵巢癌55例和双侧卵巢癌27例。所有患者在手术前均未进行过化疗和放疗。卵巢癌患者平均随访5.2年，最长8.3年，死亡29例，存活50例，生存信息不祥41例。选取癌旁正常组织35例作为对照。

1.2 标本处理

①冷冻标本：手术后将肿瘤或癌旁卵巢组织（距离至少1cm）编号放入冻存管迅速置于液氮中速冻，?80℃冰箱保存，用于测定基因mRNA表达。②石蜡样本：手术后将肿瘤或癌旁卵巢组织放入福尔马林固定24h，冲洗后进行梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后浸入石蜡包埋，用于测定基因蛋白表达。

1.3 实时定量PCR

采用液氮研磨和Trizol法提取标本组织总RNA，测定OD260／OD280值。利用逆转录试剂盒取5μg总RNA逆转录为cDNA后储存待用。实时定量PCR使用SYBR Premix Ex Taq II和CFX荧光定量仪器（Bio-RadLaboratories）检测，结果分析使用2-ΔΔCT计算。HMGN5和-actin基因的引物如下：HMGN5－Forward：5＇－TAC AAC AAT GCC CAA AAG AAA GGC T－3＇，HMGN5Reverse：5＇－TGT AAC TGG CAC AAG CAT AGC AGA－3＇；-actin Forward：5＇－CCA CGA AAC TAC CTT CAA CTC C－3＇，-actin Reverse：5＇－GTG ATC TCC TTC TGC ATC CTG T－3＇。

1.4 免疫组化

HMGN5抗体购于Abbexa公司。免疫组化操作参考文献［4］。一抗按1：100稀释，通过细胞染色强度进行免疫组化结果定性分析，染色强度≤10%为阴性，＞10%为阳性。

1.5 统计学方法

应用软件SPSS17.0进行数据分析，HMGN5基因的mRNA表达水平用均数±标准差表示，采用t检验和χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本组织中HMGN5的mRNA表达

35例卵巢癌组织、21例癌旁组织进行了定量PCR检测，结果表明，HMGN5的mRNA在卵巢癌旁组织中表达（1.250±0.1980）低于卵巢癌组织水平（4.589±0.2606）（P＜0.0001）。

2.2 标本组织中HMGN5蛋白表达

120例卵巢癌组织、35例癌旁组织进行了免疫组化分析，HMGN5表达阳性在癌旁组织标本中有5例，阳性表达率14.3%；在卵巢癌组织标本有88例，阳性表达率73.3%。两组阳性率有统计学差异（P＜0.001）。染色结果见图1。

2.3 卵巢癌患者临床病理特征与HMGN5表达相关性分析

统计分析显示，卵巢癌患者HMGN5蛋白表达与其肿瘤大小、TNM分期和生存状态密切相关（P＜0.05）；与患者年龄、肿瘤位置、病理分级和组织学类型等未见有关（P＞0.05），见表1。

表1 不同临床特征卵巢癌患者HMGN5蛋白表达比较［例（%）］

3 讨论

卵巢癌是一种发病率高但非常隐蔽的妇科恶性肿瘤，早期表现不明显、筛查难以发现异常，许多患者发现时已为肿瘤晚期并出现了大面积转移，而且在后期化疗治疗过程中易产生耐药，卵巢癌死亡率高居女性肿瘤前列［5－6］。目前治疗卵巢癌的手段主要是采用外科手术切除和综合化疗的方式。然而，由于大多数卵巢癌患者化疗后都会产生不同程度抵抗，使卵巢癌患者的5年生存率非常低［5］。因此，急需针对不同患者耐药程度制定个性化治疗方案，从而提高患者的生存时间和生活质量。

已有研究表明，HMGN5基因在多种人类肿瘤中表达明显上调。在前列腺癌体内外实验均表明，降低HMGN5基因表达能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖能力［7］；在膀胱癌中HMGN5基因能明显促进膀胱癌细胞的生长、增殖和侵袭能力［8－9］；在肾癌体内外研究显示，HMGN5基因表达降低能够抑制透明肾细胞癌细胞的生长和侵袭能力［10］；在肺癌中干扰HMGN5基因表达会显著导致肺癌细胞的细胞周期阻滞［11］；在乳腺癌中HMGN5基因表达明显上调，且能促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力［12］；在骨肉瘤中HMGN5基因表达与临床分期关系密切，抑制HMGN5表达能够导致肿瘤细胞周期阻滞，抑制细胞侵袭和增加阿霉素诱导细胞凋亡的敏感性［13］；在神经胶质瘤中干扰HMGN5表达致使肿瘤细胞周期阻滞到G1期、细胞增殖延缓，并出现更多的凋亡细胞［14］。然而，HMGN5基因在卵巢癌中的表达和作用目前并不清楚。本研究发现，HMGN5在卵巢癌组织的表达量明显高于癌旁组织，且卵巢癌样本中蛋白表达阳性率高于卵巢癌旁组织，这些结果提示HMGN5很可能参与了卵巢癌的发病进程，而且很可能是一个癌基因。

肿瘤大小和TNM临床分期在一定程度上反映了肿瘤最基本的生物学特征。本文进一步分析发现，HMGN5蛋白阳性表达与卵巢肿瘤大小和临床分期密切相关，推断HMGN5表达上调与肿瘤进展和恶性程度关系密切。由于肿瘤进展和恶性程度影响卵巢癌患者的预后，推测HMGN5的阳性表达可能与患者生存时间有关。通过深入分析也发现了密切关系。这些结果表明，HMGN5可能在卵巢癌的进展和转移过程中发挥重要功能，并可能成为评估卵巢癌患者预后的生物标志物。

卵巢癌化疗后出现明显的化疗抵抗是患者死亡率高的重要原因。最近有研究发现，HMGN5基因表达能够明显影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［15－17］。提示 HMGN5基因阳性表达与患者不良预后呈正相关关系，可能与肿瘤细胞化疗敏感性密切关联，但这一结论还需深入研究予以证明。

综上所述，HMGN5基因参与了卵巢癌的发生发展进程，是一个潜在检测标志物，可能作为肿瘤治疗靶标和患者预后评估指标。