温肾固疏方对去势大鼠骨组织中Ⅰ型胶原及组织蛋白酶 K 表达的影响

朱媛媛 郭海英* 孙振双 徐道明 沈蕴茹 陶文静 孙菁

1. 南京中医药大学，江苏 南京 210000 2. 河南省人民医院，河南 郑州 450000 . 江苏省中医院针灸康复科, 江苏 南京 210000

绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于妇女绝经后雌激素分泌减少，相对稳定状态被破坏,骨重建偶联过程失衡，所导致的全身性、代谢性骨病[1]。PMOP与其常见并发的骨折严重影响了绝经后妇女的健康，其发病率预计会随着寿命的延长而增长。温肾固疏方以补肾壮骨为组方原则，临床应用于PMOP的治疗且安全有效。本研究通过建立PMOP大鼠模型，观察温肾固疏方对去卵巢大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原(Col I) 代谢、破骨细胞组织蛋白酶K(cathepsin K,Cath K)表达的影响，探求温肾固疏方治疗PMOP的作用机制，以期为PMOP的防治提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 动物

健康9月龄未孕SPF级雌性SD大鼠48只,体重(350±30)g，由南京中医药大学实验中心提供，合格证号SYXK(苏)2014-0001-201508662。本实验操作均于SPF级动物房完成,实验过程中对动物的处置均依据科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 仪器、药物及试剂

温肾固疏方各中药均购置于南京中医药大学百草堂，共7味药：熟地、淫羊藿、枸杞、党参、丹参、骨碎补、补骨脂，按比例配伍，煎煮浓缩; 戊酸雌二醇(德国拜耳医药保健有限公司); 10%水合氯醛溶液(中国人民解放军第一医院)；青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)；血清 I 型前胶原羧基末端前肽(PICP)、Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(ICTP)、Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(NTX)和Ⅰ型胶原交联碳端肽(CTX)试剂盒(南京翼飞雪生物科技有限公司)；Col I、Cath K抗体(SAB公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 去势大鼠骨质疏松模型的建立:用双侧性腺(卵巢)摘除法[2]制备PMOP大鼠模型。把SD大鼠随机分为两组: 假手术组(SHAM，n=8)和去卵巢组(OVX，n=40)。麻醉后在无菌条件下，固定大鼠使其呈俯卧位，OVX 组行背部切口剪除双侧卵巢，分层缝合。SHAM组大鼠行背部切口，切除卵巢旁脂肪1 g，不切除卵巢。最后每只大鼠经后肢肌注8万U青霉素,密切观察一周。

1.3.2 分组及干预:随机把OVX组大鼠分为5组，8只/组。分为:模型组、雌激素组、温肾固疏方高、中及低剂量组。大鼠常规饲养，每周称重1次。手术1个月后切口愈合，开始对大鼠分组干预。大鼠同类药等效剂量按照成人的6.3倍计算，给药容积0.5 mL/100 g。温肾固疏方高剂量组:温肾固疏方[21.21 g/(kg·d) 生药]；中剂量组:温肾固疏方[10.605 g/(kg·d) 生药]；低剂量组:温肾固疏方[5.3 025 g/(kg·d) 生药];雌激素组:戊酸雌二醇[10 μg/(kg·d)];模型组和假手术组均给予生理盐水0.5 mL/100 g灌胃。各组均连续灌胃2个月。

1.3.3 标本的釆集及测定: 大鼠末次灌胃给药后，禁食24 h后取材。处死前称量大鼠体重，腹腔注射10%水合氯醛溶液(35 mg/kg) 进行麻醉，右心室抽血处死。血液收集后，4 ℃静置3 h，3 000 r/min 离心10 min，分离血清。用酶联免疫法(ELISA)法检测PICP、ICTP、CTX、NTX含量。骨标本收集:大鼠处死后，取左侧股骨置于4%多聚甲醛中固定，待做石蜡切片，用于骨形态学观察和免疫组化。肾脏收集后，待做石蜡切片，用于形态学观察。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 骨组织形态学观察

光镜下观察病理切片显示，假手术组大鼠股骨形态正常，骨小梁结构正常，排列整齐且紧密，间隙较小(图1 A);模型组与假手术组相比，大鼠骨小梁变细，存在连续性中断，排列稀疏，间隙较大，视野中大量骨陷窝空泡，提示造模成功(图1B);各干预组中，温肾固疏方高剂量组大鼠股骨形态基本恢复正常，骨陷窝空泡消失。温肾固疏方低、中、高剂量组和雌激素组与模型组相比，骨小梁结构有所恢复，骨陷窝空泡逐渐减少，且中药组疗效与浓度有关，高剂量组疗效优于中、低剂量组，见图1C～图1F。

图1 温肾固疏方对去势大鼠骨形态的影响(HE，×200) TB:骨小梁；BM：骨髓腔; A：假手术组; B：模型组; C：雌激素组; D：温肾固疏方低剂量组; E：温肾固疏方中剂量组; F：温肾固疏方高剂量组。Fig.1 Effects of the warming kidney and astringing formula on bone morphology in rats with osteoporosis (HE，×200) TB: trabecular bone;BM: bone marrow cavity;A:sham group;B:model group;C:estradiol valerate group;D: low-dose of the warming kidney and astringing formula group;E:middle-dose of the warming kidney and astringing formula group; F:high-dose of the warming kidney and astringing formula group.

图2 温肾固疏方对去势大鼠肾脏组织形态的影响(HE,×200) GI：肾小球；RT：肾小管;A:假手术组; B:模型组; C:雌激素组; D:温肾固疏方低剂量组; E:温肾固疏方中剂量组; F:温肾固疏方高剂量组。Fig.2 Effects of the warming kidney and astringing formula on kidney morphology of rats with osteoporosis (HE,×200) GI:glomeruli；RT：renal tubules.;A:sham group;B:model group;C:estradiol valerate group;D:low-dose of the warming kidney and astringing formula group;E: middle-dose of the warming kidney and astringing formula group; F:high-dose of the warming kidney and astringing formula group.

2.2 肾组织形态学观察

假手术组未见肾间质炎细胞浸润，肾小管结构完整，系膜细胞排列整齐，肾小管上皮细胞没有变性坏死(图2 A)；模型组出现弥散性肾间质炎细胞浸润，系膜细胞增生，系膜区基质增多，肾小管基底膜明显增厚，肾小管上皮细胞存在肿胀、变性及部分小管呈灶状萎缩(图2B)；中药各组与雌激素组肾间质炎细胞浸润减弱，肾小球基底膜增厚得到缓解,系膜细胞增生、系膜区基质增多有所减轻，见图2C～图2F。

2.3 血清骨转化指标PICP、ICTP、NTX 和CTX的测定

假手术组与模型组相比较，血清ICTP、NTX、CTX明显降低(P<0.01)，而PICP含量虽降低，但无统计学意义;与模型组相比较，雌激素组血清ICTP、NTX、CTX明显降低(P<0.01)，PICP含量升高，但无统计学意义；温肾固疏方低剂量组血清ICTP含量明显降低(P=0.001)，NTX含量降低(P<0.01)，CTX含量降低(P=0.05)，PICP含量升高，但无统计学意义；中药温肾固疏方高、中剂量组血清ICTP、NTX、CTX显著降低(P<0.01)，PICP含量明显升高(P<0.01)。见表1。

PICP/ (ng/L)ICTP/ (ng/L)NTX/(nmol/L)CTX /(ng/L)假手术组6.00±0.66502.08±56.04*9.06±0.66*64.65±10.83*模型组6.71±0.441130.26±87.0914.79±0.73203.14±6.91雌激素组7.43±0.80561.91±44.95*10.01±0.48*62.10±16.02*中药低剂量组6.65±0.77981.51±55.14*10.92±0.49*190.61±9.63△中药中剂量组9.24±0.70*890.10±86.14*9.82±0.58*136.98±8.98*中药高剂量组11.91±0.45*767.41±84.93*8.67±0.40*79.39±9.49*

注：与模型组比较,*P<0.01,ΔP=0.05。

2.4 温肾固疏方对Col I蛋白表达的影响

Col I蛋白阳性染色呈黄色、棕黄色，为颗粒状或纤维状，主要在成骨细胞间质中，少量表达于骨细胞胞质中。病理显微镜下观察各组染色切片可以发现，雌激素组、假手术组、中药温肾固疏方高、中及低剂量组Col I蛋白表达呈现阳性。与假手术组相比，模型组大鼠的皮质骨及骨小梁中染色略浅，温肾固疏方高、中、低剂量组、雌激素组的灰度比模型组略有增加。免疫组织化学染色结果采用 Image Pro Plus6.0分析软件做图像分析，计算阳性区域的积分光密度(integra optical density，IOD) 计算其平均值。结果见表2、图3。

Col ICath K假手术组28.84±0.88*16.78±0.64*模型组14.64±1.3965.98±1.13雌激素组26.9±0.90*20.80±0.98*中药低剂量组18.46±1.14*55.16±1.50*中药中剂量组22.18±0.77*43.76±1.29*中药高剂量组25.88±1.72*22.62±1.48*

注：与模型组比较,*P<0.01。

2.5 温肾固疏方对Cath K蛋白表达的影响

Cath K 蛋白阳性染色为棕黄色，主要在破骨细胞胞质中，少量阳性颗粒存在于成骨细胞细胞质。病理显微镜下观察各组染色切片发现，与假手术组相比，Cath K 蛋白在模型组表达明显增多；与模型组相比，Cath K 蛋白在中药温肾固疏方组和雌激素组表达显著减少。结果见表2、图4。

3 讨论

绝经后骨质疏松症的发生与众多因素相关，主要与卵巢功能的衰退、雌激素分泌减少密切相关。《素问》提及：“女子七七，任脉虚，天癸竭”。“肾主骨，生髓”，绝经后妇女肾精亏虚，故骨骼不养，导致了PMOP的发生。补肾温阳是中医抗衰老及防治PMOP的共同治则，温肾固疏方以温肾壮骨为组方原则，临床防治PMOP疗效显著。本课题组多项实验及临床研究，均证实了温肾固疏方的疗效，与模型组相比较，温肾固疏方各治疗组大鼠的骨密度(bone mineral density, BMD)均显著升高(P<0.05)，骨形态学发生改变，并且从其抗氧化应激、调节炎细胞因子、调控ApoE水平的角度探讨了温肾固疏方抗PMOP的机制[3-5]。本次研究观察到，中药温肾固疏方组可以通过抑制Cath K的表达来抑制Col I蛋白的分解，改善骨质疏松大鼠的骨结构。

图3 温肾固疏方对去势大鼠骨组织Col I蛋白免疫组化染色结果(×200)Fig.3 Results of the warming kidney and astringing formula on immunohistochemical staining of Col I in bone tissue of rats with osteoporosis(×200)

图4 温肾固疏方对去势大鼠骨组织Cath K蛋白免疫组化染色结果(×200)A：假手术组; B：模型组; C：雌激素组; D：温肾固疏方低剂量组; E：温肾固疏方中剂量组; F：温肾固疏方高剂量组。Fig.4 Results of the warming kidney and astringing formula on immunohistochemical staining of Cath K in bone tissue of rats with osteoporosis (×200) A:sham group;B:model group;C:estradiol valerate group;D:low-dose of the warming kidney and astringing formula group;E:middle-dose of the warming kidney and astringing formula group; F:high-dose of the warming kidney and astringing formula.

现代医学研究[6]发现，绝经后妇女雌激素的流失与骨的流失呈正相关，因此雌激素替代疗法(HRT)是女性的主要骨骼保护方法。因易引发乳腺癌变和子宫内膜癌等不良事件，美国食品及药物管理局(FDA)下达安全警告，并建议慎用雌激素替代疗法用于预防和治疗骨质疏松治症[7]，临床常用的其他西药也副作用层出。近来，对于具有抗骨吸收以及与合成代谢相关的药物研发日渐增多，比如以Cath K为靶点的抑制剂,拥有良好的应用前景。本课题组使用方药为郭海英教授研制的温肾固疏方，依据PMOP患者肾虚精亏，髓减骨枯为根本病机，建立补肾壮骨之法，兼补益脾气，活血化瘀之效。本方由7 种药物组成，以淫羊藿、熟地黄共为君药，温肾阳、滋肾阴；党参健脾益气；补骨脂脾肾双补；丹参活血补血；枸杞、骨碎补补肾温阳，填精益髓。全方共奏补肾壮骨、健脾益气之功。药理学研究[8-10]发现，淫羊藿、补骨脂、骨碎补等中药存在有类雌激素样作用的黄酮类物质。淫羊藿可以双向调节骨代谢，淫羊藿总黄酮明显下调PMOP大鼠的 Cath K 表达，促进COLI蛋白的合成,抑制骨吸收，减少破骨细胞陷窝形成，从而提高大鼠骨 BMD,改善骨质量[11-12]。补骨脂可有效的提高大鼠的血清骨钙素含量[13]，此外，补骨脂中可能富含多个具有抑制 Cath K 活性作用的成分[14]。骨碎补提取物，与激酶抑制药渥曼青霉素(WT)作用类似, 在骨吸收过程中抑制Cath K 前体的胞内转运与表达[15-17],骨碎补总黄酮能增强骨组织COLⅠ的表达，降低骨转换率[9]。研究表明[18-19]，丹参可以抗骨质疏松，其水提物主要成分丹参素可以显著降低破骨特异性基因Cath K。

Col I是人体最丰富的胶原类型, 是主要的骨结构蛋白，占骨基质的 80%～90%。Cath K是参与骨吸收的一种关键蛋白酶，是破骨细胞中最主要、表达水平最高的细胞因子。具有活性的Cath K，降解一系列的骨基质成分，尤其是Col I蛋白[20]。Cath K降解Col I蛋白的N-端肽，产生NTX，降解Col I蛋白的 C-端肽，产生 CTX。血清和尿液中的 CTX 和 NTX 被认为最能反映骨胶原纤维降解并具有反映骨吸收最敏感、最特异的生化指标，且对骨质疏松症患者的诊断和疗效评估均具有重要意义[21]。原胶原羧基端的非胶原结构PICP，在胶原形成时被切除，水解成进入血液，所以，血液中PICP水平反映了胶原合成速率、成骨细胞的活性[22]。ICTP是成熟的Ⅰ型胶原交联物的一部分,于Col I蛋白降解时释放，其与Col I蛋白降解的比例为 1∶1。所以，血清中ICTP在反映骨吸收中是高度特异性的敏感指标。因此，联合检测血清中PICP 及 ICTP 的水平直接反映了骨Col I合成和降解状态[23]。一旦Cath K在激活的破骨细胞中高度表达，骨基质成分会被快速降解，破骨细胞代谢增强、骨吸收加快，最终形成骨质疏松症[24]。

PMOP患者血清Cath K水平增高, 与骨密度有很强的相关性[25], 由于Cath K在骨代谢中扮演着独特的角色，过度表达会导致松质骨转换增加，已成为近10年来全球代谢性疾病学术界的研究热点[26]。通过阻止Cath K 表达可以抑制骨吸收及胶原分解，将有利于骨基质的稳定性[27-28]。CathK抑制剂是一种新的治疗方法，目前Cath K抑制剂的研发工作正在积极开展，其中一些抑制剂已通过临床前研究，处于不同进展的临床试验阶段。

本研究通过对去卵巢大鼠股骨形态观察、相关骨吸收生化指标的测定，表明温肾固疏方能够通过下调破骨细胞Cath K的表达从而抑制去卵巢大鼠骨组织中Col I蛋白的降解，同时促进Col I蛋白的合成，降低骨代谢转换率，改善骨小梁的结构，从而达到对绝经后骨质疏松症的防治作用。此外，对肾组织的观察发现，温肾固疏方不仅对肾功能无影响，还可以减轻PMOP大鼠存在的肾脏病理改变，改善绝经后妇女肾精亏虚的症状，起到补肾填精的作用。然而，本次研究对象为PMOP大鼠，尚需与临床试验相结合。