阿司匹林对Ⅰ型成骨不全小鼠脂肪来源间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

刘硕 刘义 王建海 赵玉霞 李光

天津医科大学基础医学院遗传学系，天津 300070

成骨不全症(osteogenesis imperfecta，OI)又称脆骨病，是一种少见的遗传性骨骼发育障碍疾病。根据Sillence分型，OI可分为Ⅰ～Ⅳ四种类型，其中Ⅰ型成骨不全症状较轻，最为常见[1]。OI的临床症状主要表现为骨质脆弱、反复多发性骨折、骨畸形、蓝巩膜等。绝大多数OI患者(85%～90%)编码Ⅰ型胶原蛋白α链的COL1A1或COL1A2基因发生突变，引起胶原合成不足或结构异常，进而导致骨骼、皮肤、牙本质、巩膜等胶原丰富的结缔组织发生病变[2]。另外，受胶原分泌减少所造成的微环境影响，OI患者的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向成骨分化的能力降低，倾向于分化为脂肪细胞[3]。

阿司匹林(aspirin，Asp)，又名乙酰水杨酸，是一种广泛使用的非甾体类抗炎药，最初因解热、镇痛的功效被应用于临床。流行病学调查[4]发现，定期服用阿司匹林可提高绝经后妇女的骨密度。近年的研究[5-6]表明，阿司匹林对MSCs的成骨分化有促进作用。但是，研究者[7-9]大多采用来源于野生基因型动物的MSCs，而阿司匹林对成骨不全来源的MSCs的成骨分化是否有同样的促进作用，至今未见报道。

本研究利用实验室建立的COL1A1缺失突变的Ⅰ型成骨不全小鼠(oim)，从其脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCscol1a1+/-)，探讨阿司匹林对ADSCscol1a1+/-增殖和成骨分化的影响及可能的作用机制，为阿司匹林用于成骨不全的治疗奠定一定的理论及实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：选取6～8周龄、基因型为col1a1+/-的C57/BL6小鼠(oim)。

1.1.2 主要试剂：组织基因组DNA提取试剂盒(美国Biomiga公司)；α-MEM培养基(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；1×PBS 缓冲液(北京索莱宝公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；阿司匹林(上海阿拉丁公司)；地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠(美国Sigma公司)；青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL(美国Hyclone公司)；MTS试剂(美国Promega公司)；CD 29/44/45(美国eBioscience公司)；细胞凋亡检测试剂盒(德国Miltenyi公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒、碱性磷酸酶染色试剂盒(上海碧云天公司)；Trizol试剂(美国Life Technologies公司)；反转录试剂盒(美国Promega公司)；荧光定量PCR试剂盒(德国Qiagen公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠基因型鉴定：新生雄性小鼠2周龄时剪尾尖提取DNA，以鼠尾DNA为模板进行PCR反应，反应体系如表1所示。反应条件为：预变性95 ℃，5 min；变性95 ℃，30 s；退火60 ℃，30 s；延伸72 ℃，45 s(35循环)；延伸72 ℃，5 min。

表1 oim小鼠基因型鉴定的反应体系

Table 1 Reaction system for genotypic identification of oim mice

反应体系(25 μL)2×Rapid Taq Master Mix12.5 μL双蒸水(ddH2O)9.5 μL上游引物1 μL下游引物1 μLDNA模板1 μL

1.2.2 ADSCscol1a1+/-的分离、培养：选取6～8周龄的oim雄性小鼠，采用颈椎脱臼法处死，并用75%乙醇浸泡消毒。无菌剪取小鼠腋下、腹股沟、背部等处的脂肪组织浸泡于α-MEM培养基中，将脂肪组织剪成细小碎块后转移至50 mL离心管，加入0.2%Ⅰ型胶原酶，37 ℃摇床上消化50 min后加1 mL胎牛血清。将细胞悬液用40 μm筛网过滤，离心后弃去上清，将细胞沉淀用含15%胎牛血清的α-MEM培养基重悬，以1×106/cm2接种于10 cm细胞培养皿。于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，3 d后换半液，5～7 d后细胞生长至80%时传代。所有实验均使用传代培养至第3代的ADSCscol1a1+/-。

1.2.3 ADSCscol1a1+/-的鉴定：流式细胞荧光分选技术(FACS)检测其表面间充质干细胞相关Marker，包括CD 29、CD 44和CD 45；将ADSCscol1a1+/-以1× 105/孔接种到24孔板，分别用成骨和成脂诱导培养基诱导培养，14 d后成骨诱导组进行ALP染色，成脂诱导组进行油红O染色。

1.2.4 MTS增殖实验：将ADSCscol1a1+/-以1× 104/孔接种到96孔板，隔天换液，对照组加入150 μL含DMSO的α-MEM培养基，实验组分别加入150 μL含0.5、1、1.5、2、5、10 mmol/L阿司匹林的α-MEM，每3天换液，培养5 d后每孔加入20 μL MTS，37 ℃孵育4 h，用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度。

1.2.5 细胞凋亡检测：将ADSCscol1a1+/-以3× 105/孔接种到6孔板，隔天换液，对照组加入含DMSO的α-MEM，实验组加入含1.5 mmol /L阿司匹林的α-MEM。3 d后收集细胞，根据试剂盒说明书操作，标记Annexin V-FITC及PI抗体，FACS检测荧光强度。

1.2.6 ADSCscol1a1+/-的诱导分化：将ADSCscol1a1+/-分为3组，对照组加入含DMSO的培养基，单纯成骨诱导组加入含DMSO的成骨诱导培养基，成骨诱导+阿司匹林组加入含1.5 mmol /L阿司匹林的成骨诱导培养基，每3天更换一次培养液。成骨诱导培养基的制备见表2。

表2 成骨诱导培养基的配制Table 2 Preparation of induction medium

1.2.7 碱性磷酸酶(ALP)染色及活性检测：将ADSCscol1a1+/-以1× 105/孔接种到24孔板，分组培养，7 d后根据试剂盒说明书进行ALP染色；将ADSCscol1a1+/-以3×104/孔接种到12孔板，分组培养，7 d后收集上清，将上清进行5倍稀释后按说明书步骤检测ALP活性。

1.2.8 成骨相关基因转录水平检测：将ADSCscol1a1+/-以3× 105/孔接种到6孔板，分组培养, 14 d后收集细胞，Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR反应(qPCR)测定成骨相关基因的转录水平，引物序列见表3。实验以gapdh作为内参，2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

表3 qPCR检测目的基因引物序列Table 3 Primers of target genes detected by qPCR

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Ⅰ型成骨不全小鼠的基因型鉴定

以鼠尾DNA为模板的PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后的结果(图1)显示，col1a1部分敲除小鼠(oim)的PCR扩增产物为533 bp；野生型小鼠(WT)的PCR扩增产物为1 623 bp。

图1 PCR鉴定oim小鼠基因型2 000 M：2 000 bp DNA Ladder Marker；B：空白对照；WT：WT对照；oim：oim对照。Fig.1 Identification of genotypes of oim by PCR2 000 M：2 000 bp DNA Ladder Marker；B：Blank；WT：WT control；oim：oim control.

2.2 ADSCscol1a1+/-的培养及鉴定

ADSCscol1a1+/-的细胞形态如图2 A所示，原代培养(P0)中，第3天换液时有大量圆形悬浮细胞，4～5 d贴壁细胞增多，可见散在集落式分布，5～7 d细胞呈梭形或不规则形，细胞体积增大，相邻集落融合，铺满培养皿底80%以上即可进行传代。传代后细胞(图2 A，P1)呈长梭形，后期呈漩涡式生长，增殖较快，3 d左右可传代1次。流式鉴定结果(图2B)显示，培养至第3代的ADSCscol1a1+/-(图2 A，P3)高表达间充质干细胞相关Marker CD 29和CD 44，不表达白细胞Marker CD 45。经成骨、成脂诱导培养基分别诱导后，ALP染色和油红O染色结果(图2C)显示成骨、成脂诱导成功，证明分离得到的ADSCscol1a1+/-具有多向分化潜能，为典型的间充质干细胞。

图2 ADSCscol1a1+/-的培养及鉴定A：原代、第1代和第3代ADSCscol1a1+/-的培养观察(10×)；B：ADSCscol1a1+/-的流式鉴定；C：ADSCscol1a1+/-的成骨、成脂分化潜能鉴定。Fig.2 Culture and identification of ADSCscol1a1+/-A:ADSCscol1a1+/-culture of P0, P1 and P3; B: FACS identification of ADSCscol1a1+/-; C: Osteogenesis and adipogenic differentiation identification of ADSCscol1a1+/-.

2.3 阿司匹林对ADSCscol1a1+/-增殖及凋亡的影响

将ADSCscol1a1+/-用含有不同浓度阿司匹林的完全培养基培养5 d，MTS增殖实验结果(图3 A)表明，阿司匹林在低、中浓度(0～2 mmol/L)时可促进ADSCscol1a1+/-增殖，高浓度(5～10 mmol/L)时则抑制增殖，且在1.5 mmol/L时促进增殖的效果最佳(***P<0.001；*P<0.05)，因此，后续实验均选择1.5 mmol/L的浓度对细胞进行处理。流式分析阿司匹林处理5 d的ADSCscol1a1+/-的凋亡情况，与未处理的对照组相比，阿司匹林组的凋亡细胞所占比例明显减少(图3B，P<0.05)，显示阿司匹林具有抑制ADSCscol1a1+/-凋亡的作用。

图3 阿司匹林对ADSCscol1a1+/-增殖及凋亡的影响A：不同浓度阿司匹林处理后MTS增殖吸光度检测柱状图(***P<0.001;*P<0.05)；B：1.5 mmol/L阿司匹林处理5 d后流式细胞仪检测凋亡细胞所占比例(*P<0.05)。Fig.3 Effects of aspirin on the proliferation and apoptosis of ADSCscol1a1+/-A:MTS assay post different concentrations of aspirin treatment (***P<0.001;*P<0.05); B:Percentage of apoptotic cells detected by FACS after 5 days of 1.5 mmol/L aspirin treatment(*P<0.05).

2.4 阿司匹林对ADSCscol1a1+/-成骨分化的影响

将ADSCscol1a1+/-分组进行成骨诱导，7 d后ALP染色及活性测定结果(图4 A)显示，与对照组或单纯成骨诱导组相比，成骨诱导+阿司匹林组的ALP染色深、活性显著升高(P<0.001)。同时，利用qPCR对成骨相关因子的表达量进行分析，结果表明与单纯成骨诱导组相比，阿司匹林处理组的Ⅰ型胶原蛋白和骨钙蛋白的编码基因col1a1和bglap以及成骨相关转录因子runx2和osterix的mRNA表达量均有明显上调(图4B，*P<0.05；**P<0.01)。以上结果表明，阿司匹林有促进ADSCscol1a1+/-向成骨方向分化的作用。

图4 阿司匹林对ADSCscol1a1+/-成骨分化的影响A：ADSCscol1a1+/-分组成骨诱导后的ALP染色鉴定(10×)和ALP活性检测(***P<0.001)；B：qPCR检测ADSCscol1a1+/-分组成骨诱导后成骨相关基因的转录水平(*P<0.05；**P<0.01)。Fig.4 Effect of aspirin on osteogenic differentiation of ADSCscol1a1+/-A:ALP staining and ALP activity detection of ADSCscol1a1+/-after osteogenic induction (***P<0.001); B:Transcription level of osteoblast-associated genes were detected by qPCR after osteogenic induction(*P<0.05；**P<0.01).

2.5 阿司匹林促进ADSCscol1a1+/-成骨分化的机制

Wnt信号通路和TGF-β信号通路是两个经典的成骨相关信号通路。qPCR检测ADSCscol1a1+/-成骨诱导7 d后Wnt通路中关键因子β-catenin以及TGF-β通路中bmp2的mRNA表达量，结果显示这两个因子在成骨诱导+阿司匹林组中的表达显著高于单纯成骨诱导组(图5 A、5B，*P<0.05；**P<0.01)。说明阿司匹林可能通过激活Wnt/β-catenin通路和BMP2介导的TGF-β通路来促进ADSCscol1a1+/-向成骨方向分化，但具体机制仍有待于深入研究。

图5 阿司匹林对ADSCscol1a1+/-中β-catenin和bmp2转录水平的影响Fig.5 Effect of aspirin on transcriptional expression of β-catenin and bmp2 in ADSCscol1a1+/-

3 讨论

目前，临床上对OI的治疗以外科手术为主，双膦酸盐、生长激素等药物为辅，但这些治疗无法从根本上改变患者的胶原合成缺陷。为此，研究者们致力于探讨基因治疗、干细胞治疗等前景广阔的疗法[10-11]。OI患者的干细胞在治疗过程中应用的多为骨髓MSCs，但骨髓MSCs只占骨髓单核细胞的0.01%～0.1%，自骨髓中分离获得的细胞数量有限，提取过程还会对人体骨骼造成伤害。相比之下，ADSCs具有与骨髓MSCs相似的分化潜能与低免疫原性，而且来源广泛，只需少量脂肪组织即可获得大量的干细胞，对人体损伤也较小，适宜自体或异体移植[12]。研究[13-14]发现，OI患者及小鼠来源的MSCs成骨分化能力减弱，成脂分化能力增强，采用药物促进其成骨分化，可对OI的治疗产生积极影响。因此，寻找能够促进MSCs成骨分化又安全有效的药物意义重大，本实验首次证实了阿司匹林对oim小鼠来源ADSCs的成骨分化具有促进作用。

近年来，阿司匹林在骨代谢和MSCs成骨分化方面的作用不断被发现。Carbone等[15]的流行病学统计表明，服用阿司匹林的患者骨密度有显著提高。Cao等[8]证明阿司匹林在体外能促进骨髓MSCs的增殖及成骨分化，并且可促进MSCs在迷你猪骨缺损处的骨生成作用；Liu等[9]的研究揭示阿司匹林作用于人脱落乳牙干细胞后可促进其成骨分化；Abd等[7]发现阿司匹林处理牙周膜干细胞后，其增殖能力有所提高且成骨分化增强。这些研究证实，阿司匹林具有促进MSCs成骨分化和加速骨组织修复的作用。

本实验以oim小鼠来源的ADSCscol1a1+/-为研究对象，发现低、中浓度(0～2 mmol/L)的阿司匹林可促进细胞增殖。另外，阿司匹林处理5 d后凋亡细胞所占比例明显下降，这可能是因为阿司匹林对肿瘤坏死因子(TNFα)有抑制作用[16]，从而抑制了ADSCscol1a1+/-的凋亡。ALP是成骨早期表达的标志性分子之一，ALP染色和活性检测均表明，阿司匹林可增加ADSCscol1a1+/-的ALP表达量。qPCR结果显示，成骨诱导+阿司匹林组的col1a1、bglap等成骨相关基因的表达水平有明显上调。笔者的结果首次证明，阿司匹林对oim小鼠来源的ADSCs具有促进成骨分化的作用。

作为一种非选择性的环氧合酶(cyclo- oxygenase，COX)抑制剂，阿司匹林与多种生物信号途径相关[18-20]。Liu等[9]的研究显示，阿司匹林是通过TERT/ Wnt/β-catenin通路促进脱落乳牙干细胞的成骨分化。 MSCs的成骨分化受到多种信号途径的调控，除Wnt/β-catenin通路外，影响较大的还有TGF-β/BMPs信号通路[21-24]。笔者的qPCR结果表明，Wnt通路中的β-catenin和TGF-β通路中bmp2基因转录水平均有明显上调。因此阿司匹林可能通过Wnt/β-catenin以及TGF-β这两个经典的成骨相关信号通路影响ADSCscol1a1+/-的成骨分化，但具体的机制还需要进一步研究[25-28]。

综上，本研究首次发现阿司匹林可促进Ⅰ型成骨不全小鼠ADSCs的成骨分化，作用的途径可能是Wnt/β-catenin和TGF-β信号通路，这为阿司匹林以及ADSCs应用于成骨不全的治疗奠定了一定的理论和实验基础。