3-(4′-苯甲酰基氨基-苯基)-香豆素衍生物的合成及体外降血糖活性

胡玉恒，孙 捷，杨 洁，王晓静*

(1济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南 250200；2山东省医学科学院药物研究所，济南 250062；3国家卫生部生物技术药物重点实验室，济南 250062；4山东省罕见病重点实验室，济南 250062)

芳基香豆素是以芳基苯并吡喃酮为骨架的天然产物。近年来，芳基香豆素衍生物的合成与活性研究已成为活性天然产物研究的热点之一，具有多种结构修饰类型的芳基香豆素衍生物被设计、合成得到，并在此基础上做了大量的活性研究[1-3]。研究表明芳基香豆素衍生物具有多种生物活性，如抗肿瘤[4]、抗白血病[5]、抗过敏[6]、抗炎[7]、抗氧化剂[8]、抗菌[9]等。

糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，其主要特征是持续性的高血糖[10]，最终导致人体内碳水化合物、脂质和蛋白质等代谢的改变[11]。α-葡萄糖苷酶是锚定在小肠刷状缘一种特定的酶，主要负责催化碳水化合物的水解[12]，其抑制剂可用于治疗2型糖尿病[13]。晚期糖基化终产物(AGEs)形成抑制剂能与多种受体相互作用关闭多个信号传导通路，减少相关因子的合成和释放，进而达到降血糖和减轻糖尿病的并发症[14]。最近的研究表明含有香豆素骨架的化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性[15-16]，结合本课题组之前对4-芳基香豆素降血糖活性的研究[2]，本研究设计、合成了一系列的3-芳基香豆素衍生物并对其体外降血糖活性进行评价。

1 合成路线

目标化合物7a～7j的合成路线如图1所示。对氨基苯乙酸1和取代水杨醛2a～2c在乙酸酐和三乙胺的混合液中发生Perkin反应得到化合物3a～3c，然后化合物3a～3c经过盐酸酸化得到中间体3-芳基香豆素类化合物4a～4c；以取代苯甲酸5a～5g在草酰氯的作用下来制备取代苯甲酰氯6a～6b；中间体3-芳基香豆素类化合物4a～4c与取代苯甲酰氯6a～6b在丙酮和吡啶的混合液中发生酰胺化反应得到目标化合物7a～7j。

Scheme1 Synthetic route of the title compounds7a-7c
(a) Acetic anhydride,Et3N,115 °C;(b) HCl ethanol;(c)(COCl)2,DCM,reflux;(d)4a-4c,acetone,pyridine,r.t.

2 实验部分

2.1 材 料

核磁共振仪(德国BrukerAM-600);F-280双光速荧光分光光度计(天津港东科技发展股份有限公司)；318C+酶标仪(上海沛欧分析仪器有限公司)。

对氨基苯乙酸(纯度≥96%)、2、4-二羟基苯甲醛(纯度≥98%)、2、3、4-三羟基苯甲醛(纯度≥98%)、草酰氯(纯度≥98%)、邻香草醛(纯度≥99%)、间甲基苯甲酸(纯度≥99%)、间氯苯甲酸(纯度≥99%)、邻氟苯甲酸(纯度≥98%)、对氯苯甲酸(纯度≥99%)、3、5-二甲基苯甲酸(纯度≥98%)、对氟苯甲酸(纯度≥98%)、4-三氟甲基苯甲酸(纯度≥98%)、2、3-二氯苯甲酸(纯度≥97%)、对氯甲基苯甲酸(纯度≥98%)、氨基胍盐酸盐、阿卡波糖，以上试剂均来自上海麦克林生化科技有限公司；α-葡萄糖苷酶制剂(美国Sigma Aldrich公司)；丙酮、吡啶、二氯甲烷、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺等均为市售分析纯。

2.2 化学合成

2.2.1 中间体3-(4′-氨基苯基)-7-羟基香豆素(4a)的合成 在100 mL的三口反应瓶中，依次加入2,4-二羟基苯甲醛(2a，1.38 g，10 mmol)、对氨基苯乙酸(1，1.51g，10 mmol)、三乙胺(5.56 g，55 mmol)和乙酸酐(6.12 g，60 mmol)，于115 ℃下回流搅拌，TLC监测反应进程，反应6 h 后将反应液倒入冰水100 mL中并用磁力搅拌器不断搅拌，析出大量固体，静置，抽滤，用水洗涤滤饼3～4次，真空干燥箱干燥，不经过纯化直接进行下一步反应。将上一步得到的化合物加入到无水乙醇30 mL中加热 10 min后，加入盐酸(10%)40 mL进行酸化反应6 h，反应完毕后将反应液倒入冰水100 mL中，析出大量的淡绿色固体粉末，减压抽滤，真空干燥箱干燥，得到化合物4a1.97 g，产率78%，mp：294.3～296.4 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:10.67(1H,s,7-H),8.09(1H,s,4-H),7.64(2H,d,J=8.6 Hz,Ar-H),7.58(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),7.07(2H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.84(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.77(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:161.52,160.65,155.12,140.22,130.19,129.76,122.22,119.07,113.86,112.54,102.17。m/z:253.8[M+H]+。

2.2.2 中间体3-(4′-氨基苯基)-8-甲氧基香豆素(4b)的合成 中间体4b的合成方法同化合物4a。淡黄色固体粉末，产率82%，mp：267.6～269.5 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:8.24(1H,s,4-H),7.77(2H,d,J=8.6 Hz,Ar-H),7.35～7.30(3H,m,Ar-H),7.27(2H,d,J=8.4 Hz,Ar-H),3.93(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:159.93,146.70,142.60,140.62,130.20,126.69,125.06,121.13,120.52,120.23,114.30,56.56。m/z:269.09[M+H]+。

2.2.3 中间体3-(4′-氨基苯基)-7,8-二羟基香豆素(4c)的合成 中间体4c的合成方法同化合物4a。淡黄色固体粉末，产率72%，mp：305.9～308.4 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:8.15(1H,s,4-H),7.84～7.74(2H,m,Ar-H),7.37(2H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),7.11(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.88(1H,d,J=8.4 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:160.49,150.21,143.64,142.28,132.34,130.03,122.54,121.39,119.71,113.39,113.17。m/z:270.07[M+H]+。

2.2.4 取代苯甲酰氯6a～6g的合成 以间甲基苯甲酰氯的合成为例，在100 mL的三口反应瓶中，依次加入间甲基苯甲酸(0.28 g，2 mmol)、过量的草酰氯(1.28 mL，15 mmol)、重蒸过的二氯甲烷20 mL，然后滴加1～2滴N,N-二甲基甲酰胺并将混合物加热回流，TLC监测反应进程，2 h后反应完毕并将混合物冷却至室温，在真空条件下除去多余的草酰氯和二氯甲烷。粗制苯甲酰氯无需进一步纯化即可用于下一步合成反应，本实验所用到的取代酰氯6b～6g也是根据此方法制备。

2.2.5 目标化合物7a～7j合成 以化合物7a的制备方法为例，在100 mL的三口反应瓶中加入化合物4a(0.51 g，2 mmol)并加入重蒸过的丙酮20 mL，将反应瓶置于搅拌器中搅拌10 min后加入吡啶15 mL，在冰水浴的条件下滴加3-甲基苯甲酰氯，滴加完毕后撤去冰水浴，常温搅拌，TLC检测反应进程，反应7 h后将反应溶液倒入冰水100 mL中并用磁力搅拌器不断搅拌，此时析出大量固体，静置，抽滤，滤饼用水洗至中性并干燥固体。将所得到的固体加入乙醇中进行回流洗涤，冷却静置，抽滤，干燥，得到浅黄色固体7a0.63 g，收率85%，目标产物7b～7j同上述方法合成。

3-[4′-(3′-甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-7-羟基香豆素(7a) 浅黄色固体，产率85%，mp：265.2～266.7 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.59(1H,s,N-H),10.33(1H,s,7-H),8.17(1H,s,4-H),7.86(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.80(1H,s,Ar-H),7.77(1H,d,J=6.5 Hz,Ar-H),7.72(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.61(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),7.43(2H,d,J=6.6 Hz,Ar-H),6.83(1H,d,J=2.2 Hz,1H),6.76(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H),2.42(3H,s,Ar-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：166.16,161.56,160.61,155.24,140.72,139.57,138.20,135.32,132.70,130.62,130.34,128.96,128.79,128.63,125.34,122.21,120.26,113.86,112.57,102.18。m/z:371.9[M+H]+。

3-[4′-(3′-氯-苯甲酰基氨基)-苯基]-7-羟基香豆素(7b) 黄色固体，产率81%，mp：304.9～306.0 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.60(1H,s,N-H),10.47(1H,s,7-H),8.18(1H,s,4-H),8.04(1H,t,J=1.8 Hz,Ar-H),7.98～7.90(1H,m,Ar-H),7.88～7.79(2H,m,Ar-H),7.77～7.71(2H,m,Ar-H),7.68(1H,d,J=8.0,Ar-H),7.60(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),6.83(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.77(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.55,161.60,160.59,155.27,140.83,139.21,137.26,133.71,131.96,130.96,130.92,130.37,129.01,127.92,127.02,122.14,120.39,113.88,112.56,102.19。m/z:413.9[M+Na]+。

3-[4′-(2′-氟-苯甲酰基氨基)-苯基]-7-羟基香豆素(7c) 浅粉色固体，产率72%，mp：268.9～372.4 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.59(1H,s,N-H),10.54(1H,s,7-H),8.16(1H,s,4-H),7.80(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.71(3H,d,J=5.1 Hz,Ar-H),7.61(2H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),7.36(2H,d,J=2.5 Hz,Ar-H),6.83(1H,d,J=2.3 Hz,Ar-H),6.77(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：163.29,161.59,160.59,155.27,140.80,139.17,130.90,130.42,130.40,130.36,129.13,125.07,125.05,122.14,119.73,116.73,116.59,113.87,112.55,102.18。m/z:376.0[M+H]+。

3-[4′-(4′-氯-苯甲酰基氨基)-苯基]-7-羟基香豆素(7d) 浅绿色固体，产率80%，mp：313.2～315.0 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.59(1H,s,N-H),10.43(1H,s,7-H),8.17(1H,s,4-H),8.08～7.98(2H,m,Ar-H),7.89～7.82(2H,m,Ar-H),7.78～7.69(2H,m,Ar-H),7.67～7.57(3H,m,Ar-H),6.83(1H,d,J=2.3 Hz,Ar-H),6.76(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.93,161.58,160.59,155.26,140.80,139.31,136.96,133.99,130.86,130.36,130.15,128.99,128.97,122.16,120.36,113.87,112.56,102.18。m/z:391.9[M+H]+。

3-[4′-(2′,3′-二甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-7-羟基香豆素(7e) 白色固体，产率72%，mp：250.2～252.3 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.58(1H,s,N-H),10.28(1H,s,7-H),8.17(1H,s,4-H),7.85(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.75～7.66(2H,m,Ar-H),7.64～7.53(3H,m,Ar-H),7.23(1H,s,Ar-H),6.83(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H),6.76(1H,d,J=2.2 Hz,Ar-H),4.35(1H,t,J=5.1 Hz,Ar-H),2.37(6H,s,Ar-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：166.27,161.55,160.61,155.24,140.70,139.61,138.05,135.35,133.39,130.56,130.34,128.94,125.86,122.23,120.23,113.86,112.57,102.18。m/z:386.1[M+H]+。

3-[4′-(4′-氟-苯甲酰基氨基)-苯基]-8-甲氧基香豆素(7f) 白色固体，产率78%，mp：296.5～297.8 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.42(1H,s,N-H),8.26(1H,s,4-H),8.07(2H,s,Ar-H),7.88(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),7.78(2H,d,J=8.2 Hz,Ar-H),7.39(2H,t,J=7.6 Hz,Ar-H),7.36～7.26(3H,m,Ar-H),3.94(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：165.00,163.79,159.97,146.72,142.60,140.34,139.99,131.70,130.99,130.93,130.16,129.30,126.91,125.02,120.62,120.30,120.23,115.93,115.79,114.24,56.58。m/z:390.1[M+H]+。

3-[4′-(4′-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-8-甲氧基香豆素(7g) 白色固体，产率68%，mp：298.1～301.5 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.63(1H,s,N-H),8.27(1H,s,4-H),8.18(2H,d,J=8.1 Hz,Ar-H),7.94(2H,d,J=8.3 Hz,Ar-H),7.90(2H,d,J=8.8 Hz,Ar-H),7.84～7.76(2H,m,Ar-H),7.40～7.27(3H,m,Ar-H),3.94(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.95,159.95,146.72,142.62,140.44,139.71,130.47,129.36,129.15,126.86,125.92,125.89,125.02,120.61,120.38,120.24,114.26,56.57。m/z:461.9[M+Na]+。

3-[4′-(3′-氯-苯甲酰基氨基)-苯基]-8-甲氧基香豆素(7h) 白色固体，产率81%，mp：265.3～266.7 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.50(1H,s,N-H),8.27(1H,s,4-H),8.04(1H,s,Ar-H),7.95(1H,d,J=7.5 Hz,Ar-H),7.88(2H,d,J=8.2 Hz,Ar-H),7.79(2H,d,J=8.2 Hz,Ar-H),7.69(1H,d,J=7.8 Hz,Ar-H),7.59(1H,t,J=7.8 Hz,Ar-H),7.41～7.24(3H,m,Ar-H),3.94(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.63,159.96,146.73,142.62,140.41,139.78,137.22,133.72,132.01,130.94,130.36,129.33,129.31,127.94,127.05,126.88,125.03,120.62,120.36,120.24,114.27,56.58。m/z:428.0[M+Na]+。

3-[4′-(2′,3′-二氯-苯甲酰基氨基)-苯基]-8-甲氧基香豆素(7i) 白色固体，产率62%，mp：258.6～261.7 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.76(1H,s,N-H),8.25(1H,s,4-H),7.83～7.74(5H,m,Ar-H),7.61(1H,d,J=7.6 Hz,Ar-H),7.51(1H,t,J=7.8 Hz,Ar-H),7.37～7.28(3H,m,Ar-H),3.94(3H,s,O-CH3)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：164.72,159.95,146.73,142.63,140.44,139.54,132.58,131.91,130.51,129.54,129.22,128.62,127.90,126.86,125.03,120.59,120.25,119.59,114.29,56.58。m/z:391.9[M+H]+。

3-[4′-(4′-氯甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-7,8-二羟基香豆素(7j) 黄色固体，产率58%，mp：285.3～286.7 ℃；1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ：10.40(1H,s,N-H),10.13(1H,s,7-H),9.41(1H,s,8-H),8.13(1H,s,4-H),7.99(2H,d,J=8.2 Hz,Ar-H),7.86(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.74(2H,d,J=8.7 Hz,Ar-H),7.61(2H,d,J=8.3 Hz,Ar-H),7.11(1H,d,J=8.5 Hz,Ar-H),6.84(1H,d,J=8.4 Hz,Ar-H),4.86(2H,s,Ar-CH2)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ：165.59,160.57,149.94,143.54,141.61,141.34,139.39,135.15,132.28,130.85,129.28,129.01,128.57,121.92,120.29,119.55,113.35,113.28。m/z:422.0[M+H]+。

2.3 体外降血糖活性测定

2.3.1α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 参照文献报道[17-18]的方法并稍做修改，对目标化合物7a～7j进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测定。取96孔板，在每个孔中依次加入PBS缓冲液(pH 6.8)、对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(PNPG)和待测化合物，每一组浓度设置3个复孔。利用混匀器将96孔板内的反应液混匀，然后置于37 ℃的恒温箱中保温10 min，之后加入酶活力为0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，使用混匀器将其混匀并在恒温箱中反应20 min，最后加入0.2 mol/L碳酸钠175 μL终止反应。利用酶标仪检测对硝基苯酚(PNP)在波长405 nm下的吸收度来反应α-葡萄糖苷酶的抑制率。通过以下公式算出所有化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率，实验结果如表1所示。抑制率=[(AC-AB)-(AS-ASB)]/(AC-AB)×100%，式中，AC为对照组吸收度；AB为空白组吸收度；AS为样品组吸收度；ASB为样品空白组吸收度。

式中，AC：50 μL PBS+50 μL PNPG底物+25 μL DMSO+175 μL碳酸钠的吸收度；AB：25 μL PBS+50 μL PNPG底物+25 μL蒸馏水+25 μL酶+175 μL碳酸钠的吸收度；AS：25 μL PBS+25 μL待测目标化合物或阿卡波糖+50 μL PNPG底物+25 μL酶+175 μL碳酸钠的吸收度；ASB：50 μL PBS+25 μL待测目标化合物或阿卡波糖+50 μL PNPG底物+175 μL碳酸钠的吸收度。

2.3.2 AGEs形成抑制活性测定 参照Ni等[19]报道的方法并做相应调整，检测了目标化合物的AGEs形成抑制活性。配制50 mmol/L 的PBS(pH 7.4)缓冲液，并用此缓冲液配制10 mg/mL牛血清白蛋白、0.2 mol/L葡萄糖、0.02%叠氮化钠溶液(起到抑菌的作用)。取5 mL的EP管，依次加入上述液体各1 mL和不同浓度的待测样品1 mL，利用混匀器将反应液混匀。将含有反应液的EP管置于37 ℃的恒温箱中反应，每组实验设定3个平行对照，14 d之后测定糖基化终产物的荧光吸收度(发射波长420 nm、激发波长350 nm)。阳性药为氨基胍盐酸盐(AG)，实验结果如表1所示。

Compd.IC50/(μmol/L)α-Glucosidase inhibitory activityAGEs form inhibitory activity7a56.61±0.54NA7b24.29±0.9631.97±2.417c42.67±0.3617.33±0.897d60.30±0.1823.02±2.457e43.47±0.98NA7f10.84±0.36NA7gNA5.01±0.557hNA15.43±0.837iNA38.15±2.277j42.75±2.1114.32±0.27Acarbose0.08±0.01NAAGNA290.31±7.32

NA：No relevant activity was detected;AG:Amino guanidine

Inhibition=[(AC-AB)-(AS-ASB)]/(AC-AB)×100%

式中，AC为对照组吸收度；AB为空白组吸收度；AS为样品组吸收度；ASB为样品空白组吸收度。

式中，AC：1.0 mL葡萄糖+1.0 mL牛血清白蛋白+1.0 mL叠氮化钠+1.0 mL DMSO的吸收度；AB：1.0 mL PBS+1.0 mL牛血清白蛋白+1.0 mL 叠氮化钠+1.0 mL DMSO的吸收度；AS：1.0 mL葡萄糖+1.0 mL牛血清白蛋白+1.0 mL叠氮化钠+1.0 mL待测样品或阳性药的吸收度；ASB：1.0 mL PBS+1.0 mL牛血清白蛋白+1.0 mL叠氮化钠+1.0 mL待测样品或阳性药的吸收度。

3 结果与讨论

本研究设计合成10个未见文献报道的3-(4′-苯甲酰基氨基-苯基)香豆素类化合物7a～7j，分别利用酶标仪和荧光分光光度计测定目标化合物7a～7j对α-葡萄糖苷酶和AGEs形成抑制活性，寻找潜在的具有降血糖活性化合物。

由表1所示，多数化合物对α-葡萄糖苷酶和AGEs形成具有一定的抑制活性。所有的目标化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性和阳性药相比具有一定的差距，但是能够检测到活性的化合物对α-葡萄糖苷酶抑制活性也都低于65 μmol/L。构效关系表明，化合物7b和7h只存在香豆素环上的7位和8位(化合物7b在7位上带有羟基，化合物7h在8位上带有甲氧基)取代基的差异，化合物7b对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性而化合物7h不具有抑制活性；化合物7f通过酰胺键连接苯环的对位含有一个氟原子取代基团，该化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性优于其他化合物。以上结果表明香豆素环7位上羟基取代位点和与酰胺键连接苯环的对位氟原子取代的位点都是α-葡萄糖苷酶抑制活性位点。所有能检测到的化合物对AGEs形成抑制活性都远高于阳性药物氨基胍盐酸盐，而且目标化合物7g对AGEs形成抑制活性高于阳性药氨基胍盐酸盐接近58倍。这些体外活性的研究为以后体内活性的研究提供了一定的理论依据，具有很好的参考价值。