miR-130b与碘难治性分化型甲状腺癌的关系研究

李德宇，李 娜，李文亮，李东丽，杨 辉，王丽君

0 引言

甲状腺癌(Thyroid carcinoma，TC)是临床上最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，近年来，随着对甲状腺良性病变及甲状腺癌筛查力度的加大，我国甲状腺癌的确诊率逐年上升[1]。90%以上的TC患者都属于分化型甲状腺癌(Differentiate thyroid carcinoma，DTC)，虽然DTC患者的预后良好，生存率较高，但是部分肿瘤细胞仍存在浸润性行为[2]。131I照射是目前临床上的主要治疗手段之一，可用于术后清甲或清除复发和转移病灶[3]。但是临床上仍有部分DTC患者治疗无效或治疗一段时间后逐渐无效[4]，因此，在131I照射前寻找新的特异性指标对于预后评估以及个体化治疗具有重要的临床意义。近年研究发现，越来越多的miRNAs与肿瘤的发生密切相关[5]，研究者开始关注miRNAs作为多种肿瘤诊断和治疗标志物的潜力。以往大多数的研究集中在诊断TC与良性结节的差异上，关于miRNAs与131I摄取的关系探讨尚少。笔者基于前期调查和研究，筛选了与DIC密切相关的miR-130b作为候选标志物，通过实验室方法检测miRNAs在碘难治性DTC(Radioiodian refractory differentiate thyroid carcinoma，RR-DTC)患者肿瘤组织中的表达情况，探讨其诊断价值及其与预后的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月至2015年12月在我院就诊并行甲状腺全切除后联合131I照射治疗的远处转移DTC患者104例，男65例，女39例，年龄28～76岁，平均年龄为(55.67±10.25)岁。收集患者新鲜组织标本，立即置于液氮中暂时保存，待送到实验室后保存至-80 ℃，用于提取组织RNA。所有患者均符合2015年由美国甲状腺学会发表的“The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer”[6]中关于DTC的诊断标准。其中甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)93例，甲状腺滤泡状癌(Follicular thyroid carcinoma，FTC)11例。本项研究获得我院伦理委员会的批准。

1.2 入选和排除标准

1.2.1 入选标准 ①行甲状腺全切除患者。②至少接受2个疗程131I照射治疗。③经病理活组织检查确诊为DTC。④所有患者均符合远处转移DTC的诊断标准：经骨穿刺或术后病理证实为远处转移；131I全身显像提示发生远处转移，甲状腺球蛋白(Thyroglobulin，Tg)水平升高，X线、CT或MRI等影像学检查中至少1种提示阳性；符合上述任意1条，可判断发生远处转移。⑤临床资料完整。⑥患者签署知情同意书。

1.2.2 排除标准 ①不符合上述纳入标准的患者；②合并其他肿瘤者；③合并严重高血压、心律失常、冠心病及心功能不全者；④合并肝肾功能严重损伤，不能耐受131I照射治疗者；⑤合并凝血功能异常或有严重出血倾向者；⑥中途自愿退出者。

1.3 研究方法

1.3.1 实验分组 随访36个月，中位随访时间为28.5个月。根据影像学检查结果，原发灶和转移灶消失或缩小即为治疗有效，将患者分为RR-DTC组和碘治疗有效组(R-DTC组)。碘治疗有效的判断标准包括治愈和好转。治愈：131I照射5～7 d，全身显像及辅助影像学检查显示原发灶及转移灶消失，Tg水平维持在2 ng/ml以下；好转：原发灶缩小，转移灶大小和数量也减少，Tg水平下降。RR-DTC诊断标准：根据2015年ATA指南，出现以下任何一项则可判断为RR-DTC：①肿瘤组织或转移灶不摄碘；②曾经摄碘的病灶在碘治疗后丧失摄碘能力；③碘治疗后仅部分病灶摄碘；④虽然病灶可摄碘，但是碘治疗后仍然出现疾病进展。

1.3.2 荧光定量实时PCR(Quantitative real-time-PCR，qRT-PCR) 提取总RNA：①取肿瘤组织样本约100 mg，置于EP管中；②加入1 ml预冷的Trizol，充分混合均匀，静置5～10 min；③加入200 μl 氯仿，震荡30 s，静置5～10 min；④12 000 r/min离心，取上清；⑤加入500 μl异丙醇，震荡30 s，静置5～10 min；⑥12 000 r/min离心，弃上清；⑦加入1 ml 75%乙醇，震荡30 s，12 000 r/min离心，弃上清；⑧将EP管倒置于滤纸上，将RNA充分干燥；⑨加入20 μl DEPC水溶解沉淀，分装，置于-80 ℃ 保存备用。采用miRNA isolation kit试剂盒提取miRNA。采用凝胶电泳检测RNA分子量；采用分光光度计检测RNA浓度。

RNA反转录：根据试剂盒说明书操作进行。将cDNA置于-20 ℃保存备用。

实时定量PCR：将20 μl反应体系置于37 ℃恒温水浴60 min，85 ℃ 5 s，加入去离子水至100 μl，各反应孔取2 μl进行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反应体系，95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环45次。根据NCBI数据库获得的资料设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。采用mirVanaTM qRT-PCR miRNA detection kit试剂盒进行定量测定。引物序列如下：miR-130b F：5′-TACCACGATAAGCAGGAAGTGA-3′，R：5′-CTCCTCTCCTGGCTTTTCTACC-3′。

结果判定：根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。ΔCt=样品Ct均值-内参Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(随机阴性对照样品Ct均值-内参Ct均值)，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相对表达量。小干扰RNA引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；DNeasy组织试剂盒、cDNA合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、miRNA isolation kit试剂盒购自德国Qiagen公司。

1.3.3 血清学检测 所有患者131I照射治疗前后分别采集血液样本，采用化学发光免疫分析法检测Tg水平，计算Tg同比下降率。Tg同比下降率=(Tgbaseline-Tg)/ Tgbaseline。

1.3.4131I全身显像半定量分析 利用SPECT Region-of-interest软件对所有患者131I照射治疗后进行131I摄取半定量分析。转移灶131I摄取(Tumor/Backgroud，T/B)=肿瘤病灶摄取量/本底摄取量(以正面额骨的摄取量为准)，比值越大，说明131I摄取越好。

2 结果

2.1 两组患者基线资料分析 影像学检查结果显示，接受131I照射治疗后，41例患者为RR-DTC，63例患者为R-DTC。两组患者年龄、性别、病理类型、累积I放射量等一般临床资料基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。但是RR-DTC组患者发生远处多发转移的比例高于R-DTC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 两组患者组织miR-130b、血清学指标、影像学指标比较 见表2、图1。131I照射治疗前，R-DTC组和RR-DTC 组患者肿瘤组织miR-130b水平分别为0.79±0.10和0.43±0.07，RR-DTC组患者miR-130b水平明显低于R-DTC组患者，而血清Tg水平高于R-DTC组患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后，R-DTC组患者血清Tg水平为(25.94±17.48)μg/L，较治疗前明显降低，同时也低于RR-DTC组患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。RR-DTC组患者Tg同比下降率和T/B分别为10.13%±9.87%和4.29%±1.64%，明显低于R-DTC组患者，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组患者基本资料比较(例)

表2 两组患者组织miR-130b表达、Tg及T/B水平比较

2.3 miR-130b与Tg同比下降率、T/B的相关性 经Spearman相关性分析结果显示，组织miR-130b与血清Tg同比下降率和T/B呈正相关性(rs=0.928、0.896，P<0.05)。见图2。

图1 qRT-PCR法检测miR-130b在R-DTC、RR-DTC患者肿瘤组织中的表达水平

2.4 miR-130b诊断ROC曲线分析 ROC曲线分析结果显示，miR-130b诊断RR-DTC的截断值为0.485，曲线下面积(Area under curve，AUC)为0.662。根据miR-130b的截断值，将41例RR-DTC患者分为<0.485亚组(23例)和≥0.485亚组(18例)。见图3。

图2 miR-130b与Tg同比下降率、T/B的相关性分析

2.5 RR-DTC生存曲线分析 随访截至2018年6月，中位随访时间为28.5个月。RR-DTC组有24例患者死亡，其中<0.485亚组有15例患者死亡，3年生存率为34.78%；≥0.485亚组有9例患者死亡，3年生存率为50.0%。采用Kanlan-Meier法对RR-DTC亚组患者进行生存分析，经Log-rank检验，<0.485亚组和≥0.485亚组患者3年生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图3 miR-130b诊断RR-DTC的ROC曲线分析

图4 Kanlan-Meier生存曲线分析

3 讨论

甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，多为分化型甲状腺癌，包括PTC和FTC两种病理类型[7]。相对于未分化性甲状腺癌或甲状腺髓样癌，DTC的总体预后良好，10年生存率可达85%以上[8-9]。目前，临床上关于DTC治疗的标准方案为甲状腺切除术+131I内照射+激素替代治疗[10]。但是有部分患者对131I内照射无效，或者初始治疗有效，经治疗一段时间后无效，对于这部分患者治疗方法的研究一直是内分泌肿瘤领域亟待攻克的难点。由于RR-DTC患者多伴有多发性转移灶，不宜采取手术治疗，且摄碘能力较弱或完全丧失，同时这类肿瘤细胞的侵袭性明显升高，给治疗和预后带来了极大挑战[11]。推测其可能的原因包括：①部分肿瘤细胞本身缺乏摄碘能力或者摄碘能力较弱；②在进行131I内照射前，肿瘤细胞摄碘能力存在较大的差异性，经内照射后，摄碘能力强的细胞被杀死，而剩余摄碘能力较弱的肿瘤细胞继续增殖、侵袭等；③经内照射后，部分肿瘤细胞代谢活性可能发生变化，从而失去碘摄取能力[12]。一旦患者被确诊为DTC，则无法继续接受131I内照射靶向治疗，需考虑其他治疗方案，包括放疗、射频消融、动脉栓塞和靶向治疗等[13]。近年来，随着对甲状腺癌发病机制研究的深入，越来越多的分子靶向药物用于临床，为RR-DTC患者带来了希望。

Tg是甲状腺癌复发和转移的特异性标志物，主要由甲状腺滤泡上皮细胞合成并分泌，在正常生理情况下，或者经甲状腺手术全切除和“清甲”治疗后，血液中Tg的含量极微；若出现肿瘤复发，则血清中Tg含量明显升高[14-15]。因此，临床上一般通过检测Tg水平预测手术后或“清甲”术后患者疾病进展。但是对于RR-DTC患者，由于“清甲”治疗无效，甲状腺病灶组织一直存在，因此，很多研究认为，血清Tg水平可作为131I治疗成功的预测指标。但是，由于血清Tg受外界因素和内在因素的影响，尤其是受甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin antibody，TgAb)的影响较大，且评估作用尚不明确，在2015年更新的ATA指南中，并没有明确推荐血清Tg用于指导临床治疗[6]。131I全身显像一直是临床上用于探查不摄碘病灶最有效的手段，但是131I全身显像也会出现假阴性结果，这可能由于部分肿瘤细胞去分化，Na/I转运能力失衡，从而影响131I的摄取[16]。因此，寻找RR-DTC更为敏感的分子标志物，对于个体化治疗具有重要的临床价值。

miRNA属于非编码基因序列，与真核生物体多数基因的表达调控均密切相关，包括癌基因和抑癌基因等。近年来，多项研究结果显示，miRNA与分化型甲状腺癌细胞的增殖、侵袭、转移、凋亡等恶性生物学行为密切相关，并可作为潜在的分子诊断工具及预后评估指标[17]。目前，国内外临床研究基本都是将miRNAs作为良、恶性甲状腺病变的诊断指标，包括miR-146b、miR-222等[18]，但是关于miRNAs与碘摄取相关性的研究尚少。最近有研究显示，一些miRNAs可能与131I摄取率有关，例如，Lakshmanan等[19]认为，miR-339-5p过表达可以抑制HEK293细胞131I摄取量，从而抑制NIS的表达。笔者在前期研究中，通过基因芯片技术筛选了碘难治性分化型甲状腺癌与碘治疗有效的DTC患者miRNAs表达的差异性，其中miR-130b、miR-486-5p、miR-7表达均明显下调，尤其是miR-130b下调最为明显，两组DTC患者比较，差异有统计学意义[P<0.05，log2(fold-change)=-1.253]。因此，笔者基于前期研究结果，通过qRT-PCRT技术分析肿瘤组织中miR-130b表达水平与RR-DTC发生的相关性。结果显示，RR-DTC患者miR-130b水平明显低于碘治疗有效组患者，但Kanlan-Meier生存曲线分析显示，miR-130b表达水平与RR-DTC患者3年生存期之间未见明显相关性，可能与本身DTC在我国的发病率较低，从而影响研究纳入的患者样本量有关。

综上所述，碘难治性分化型甲状腺癌患者肿瘤组织中miR-130b表达水平明显低于碘治疗有效的分化型甲状腺癌患者，虽然本项研究未得出关于miR-130b与碘难治性分化型甲状腺癌患者预后的相关性，但是miR-130b仍然有望成为诊断分化型甲状腺癌摄碘能力的辅助指标之一，从而为探索碘难治性分化型甲状腺癌的筛查和诊断提供了新的思路。