利鲁唑上调EAATs产生对MPTP诱导的帕金森模型小鼠的保护作用

米 超，杨欣欣，齐志鹏，吴凤迪，崔东日，邓 宇*

0 引言

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种进行性、病因不明的神经系统退行性疾病，主要发病人群为65岁以上的中老年人，临床表现以静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓、姿势步态异常等运动功能症状及睡眠障碍、精神障碍、感觉障碍等自主神经功能障碍等症状为主要特征[1]。流行病学调查显示，世界范围内PD的患病率为0.3%[2]，其中65岁以上年龄段人群占1%～2%，85岁以上年龄段人群患病率增加到3%～5%[3]。有研究显示，谷氨酸(Glutamate，Glu)的兴奋性毒性会加速PD的病理进展。散发性PD患者表现为Glu摄取量降低，而且其降低程度与PD的严重程度相关[4]。有研究显示，Glu的代谢转运障碍与谷氨酸转运体(Excitatory amino acid transporters,EAATs)有密切关系，EAATs可清除谷氨酸的堆积，进而发挥保护中枢神经系统免受Glu兴奋性毒性的作用[5]。EAAT1和EAAT2主要分布于星形胶质细胞，是Na+/K+依赖的膜蛋白，可促进Glu能突触周围的Glu代谢平衡[6]。

利鲁唑属于苯噻唑类化合物，是目前用于治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物，已有文献证实其可抑制Glu从神经末梢释放，促进Glu与谷氨酸转运体的结合[7-9]。早在2002年就有利鲁唑治疗帕金森的随机对照试验，但是未见关于利鲁唑对PD的神经保护作用的报道[10]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)能够造成小鼠黑质纹状体区多巴胺能神经元表达减少，并且出现类似人类的运动功能障碍等现象，是制备PD模型的常用方法[11-12]。本研究主要使用MPTP建立小鼠PD模型后，给予利鲁唑干预，观察小鼠行为学变化情况，以及小鼠纹状体Glu含量、EAAT1及EAAT2蛋白表达、mRNA表达情况，旨在为临床应用利鲁唑治疗帕金森病提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器 利鲁唑和MPTP购自美国Sigma公司，Glu检测试剂盒来自南京建成生物科技有限公司，鼠抗EAAT1、EAAT2及β-actin抗体来自Santa Cruz公司，HRP标记山羊抗鼠IgG、Western blot相关试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒及电泳液、RIPA buffer裂解液来自上海碧云天生物技术研究所。GDS-8000电泳凝胶成像分析系统(美国UVP公司)，1680酶标仪(美国BIO-RAD公司)，VE-180垂直电泳槽(上海天能科技有限公司)，EPS-300电泳仪和VE-186转印电泳槽(上海天能科技有限公司),722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),WD-9405B型水平摇床(北京市六一仪器厂)。

1.2 实验动物及分组 健康SPF级昆明小鼠36只，雌雄各半，体重(30±2)g。由中国医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK2013-0001。本实验经中国医科大学伦理委员会批准，并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀，符合卫生部实验动物管理与使用准则。实验动物可自由摄食饮水，饲料由中国医科大学实验动物中心提供，动物房室温18～23 ℃，相对湿度为45%～55%。实验前适应性喂养1周后将动物随机分为3组，每组12只，雌雄各半，分别为：①对照组，②MPTP组(PD模型组)，③MPTP+利鲁唑组(利鲁唑治疗组)。注射药品均以0.9% NaCl作为溶剂配制，各组均以腹腔注射的方式给予5 ml/kg的药品体积。给予对照组腹腔注射生理盐水，MPTP组和MPTP+利鲁唑组小鼠均腹腔注射25 mg/kg MPTP。2 h后，对照组及MPTP组腹腔注射生理盐水，MPTP+利鲁唑组腹腔注射0.7 mg/kg利鲁唑。各组小鼠连续处理2周。

1.3 行为学检测 转棒实验用于测试小鼠的运动协调能力。测试前对每只小鼠进行3次适应性转棒训练，每次训练时长为3 min。将小鼠置于电动转棒上，转棒直径为2.5 cm，表面为橡胶质地，转速为10 r/min，记录小鼠被置于转棒上至跌落的时间。每只小鼠重复测定3次，每次间隔30 min，重复测量3次结果，取其平均值。

疲劳仪实验用于检测小鼠运动耐力。测试前对每只小鼠进行3次适应性训练，时间长约 5 min。将小鼠置于疲劳仪转轮甬道中，通电后小鼠若不运动则会被底部电极刺激，记录小鼠被置于疲劳仪内致疲劳致不动时的时间(min)及奔跑距离(m)。每只小鼠重复测量3次取平均值。

1.4 小鼠纹状体组织匀浆内Glu含量的测定 各组取6只小鼠，分离纹状体，将部分组织制备成10%的组织匀浆，其余组织备用。使用南京建成试剂盒，根据Glu+NAD++H2O→α-oxoglutarate+NADH+NH4+的原理测定Glu含量。

1.5 Real-time RT-PCR检测小鼠黑质纹状体组织EAAT1、EAAT2的mRNA表达 根据说明书，使用Trizol法提取总RNA，样品质量检测结果260 nm/280 nm应为1.8～2.0。将提取的总RNA按照逆转录试剂盒步骤反转录为cDNA。最后进行荧光定量PCR，采用的反应体系为20 μl，其中，SYBR 10 μl、上下游引物各 1 μl、RNA free H2O 6 μl、cDNA 模板 2 μl。合成小鼠EAAT1、EAAT2及GAPDH的引物序列如表1所示。反应程序设定为：95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃ 变性 5 s，60 ℃ 退火30 s，40个循环。每次试验均设置GAPDH为内参。用 2-ΔΔCt法计算各组小鼠黑质纹状体组织EAAT1、EAAT2的mRNA表达的相对表达量。

表1 引物序列

1.6 Western blot检测小鼠黑质纹状体组织EAAT1、EAAT2的蛋白表达 各组小鼠取3只，分离纹状体，加入强效RIPA buffer裂解液(Ripa buffer∶PMSF=100∶1)，在冰上使用组织匀浆破碎机裂解成组织匀浆，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，使用BCA试剂盒测蛋白浓度，并将组织蛋白浓度定量到4 μg/μl。将40 μg蛋白样品与loading buffer缓冲液混匀，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后电转至PVDF膜，5%BSA封闭液室温封闭1 h。4 ℃过夜孵育一抗EAAT1(1∶2 000)，EAAT2(1∶2 000)，β-actin(1∶ 3000)，TBST洗膜，HRP标记的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL发光显影，每只小鼠每项指标重复测量3次。使用Image J软件分析条带光密度。

2 结果

2.1 利鲁唑对MPTP诱导的PD模型小鼠运动能力障碍的影响 如表2所示，与对照组相比，MPTP处理后，小鼠的转棒潜伏期、耐力潜伏期、跑步距离均缩短(P<0.05)。给予利鲁唑干预后，与MPTP组比较，转棒潜伏期、耐力潜伏期和跑步距离均延长(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。

2.2 利鲁唑对MPTP致小鼠纹状体Glu含量增加的影响 与对照组纹状体内Glu(23.55±5.21)μmol/g pro相比，MPTP处理组小鼠纹状体内Glu含量升高，可达(45.62±3.25)μmol/g pro(P<0.01)。给予利鲁唑治疗后，Glu含量与MPTP诱导的PD模型小鼠相比显著下降，低至(38.36±8.54)μmol/g pro(P<0.01)。此部分每组6只。

2.3 利鲁唑对MPTP致小鼠纹状体EAAT1、EAAT2表达下降的影响 应用RT-PCR方法，对纹状体内EAAT1、EAAT2的mRNA表达变化进行观察。如图1A所示，与对照组相比，MPTP组的小鼠纹状体内EAAT1的mRNA水平降低(P<0.01)；与MPTP组相比，利鲁唑干预后EAAT1的mRNA水平升高(P<0.01)。如图1B所示，MPTP组的小鼠纹状体EAAT2的mRNA水平较对照组降低(P<0.01)，而给予利鲁唑治疗后，与MPTP组相比，EAAT2的mRNA水平明显回升(P<0.01)。

2.4 利鲁唑对MPTP致小鼠纹状体EAAT1和EAAT2表达下降的影响 应用Western blot方法，对纹状体内EAAT1、EAAT2的蛋白水平变化进行观察。如图2所示，将检测到的EAAT1及EAAT2的蛋白条带进行灰度分析，目的蛋白的灰度水平与相应内参β-actin灰度值用比值表示。如图2A所示，与对照组相比，MPTP组小鼠的EAAT1蛋白水平显著降低(P<0.01)。而与MPTP组相比，在利鲁唑治疗组中，EAAT1蛋白水平显著回升(P<0.01)。如图2B所示，MPTP组EAAT2蛋白水平显著降低(P<0.01)，与MPTP组相比，给予利鲁唑治疗后，EAAT2水平显著升高(P<0.01)。

表2 利鲁唑对MPTP诱导的PD模型小鼠运动能力的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，* *P<0.01；与MPTP组比较，#P<0.05，##P<0.01

图1 各组小鼠纹状体内EAAT1及EAAT2的mRNA水平变化(n=3)

图2 各组小鼠纹状体内EAAT1及EAAT2的蛋白水平变化(n=3)

3 讨论

随着我国老龄化程度的加剧，PD的患病率急剧增长，并维持在较高水平[13]。Glu的过量堆积是PD发病机制中的一个重要环节，与PD发病密切相关。其中，EAATs转运体系统的功能失调是很多PD患者共同的特征[14]。很多针对Glu转运体调节的分子都显示出对于神经退行性病变的治疗作用，如头孢曲松、埃他卡林等[15-16]，更重要的是，上调Glu转运体也能抑制α-突触核蛋白、tau蛋白及β-淀粉样蛋白的非正常堆积[17-18]。利鲁唑属于苯噻唑类化合物，有明确的神经保护及抗惊厥等药理作用，然而，应用其干预兴奋性Glu转运体进而调节PD病理进程的研究很少。Glu转运体是Na+/K+依赖的，而利鲁唑可稳定Na+通道，抑制Glu的释放，增强Glu转运体和Glu的结合力，能有效减少Glu在细胞外的浓度[8-9]。因此，推测利鲁唑可能会对MPTP导致的PD模型鼠的Glu代谢转运障碍起到一定的保护作用。

EAAT1、EAAT2是主要表达在星形胶质细胞膜上的Glu转运体，主要任务是清除细胞外的Glu。本实验通过连续给予昆明小鼠注射25 mg/kg 的MPTP，共7 d，建立PD模型鼠，并给予0.7 mg/kg利鲁唑，以建立利鲁唑干预模型。通过转棒实验及疲劳仪实验检测小鼠的行为学变化，发现MPTP处理组的小鼠的耐力时间与奔跑距离均较对照组缩短，说明造模成功，经过MPTP处理过的小鼠均达到PD患病程度。而经过利鲁唑干预后的小鼠以上运动行为学指标都有不同程度的提升，说明利鲁唑对于PD患病小鼠确实具有显著的改善作用。MPTP组小鼠Glu水平显著高于对照组，说明PD小鼠的纹状体区发生了Glu的过量堆积或者代谢异常。而利鲁唑可能会对Glu重摄取有促进作用。为分析其原因，本研究进一步检测了纹状体EAAT1、EAAT2蛋白及mRNA 表达，结果显示，MPTP组小鼠黑质纹状体区的EAAT1、EAAT2的蛋白及mRNA水平均下降，而利鲁唑治疗后，这两种转运体的蛋白及mRNA水平较MPTP组相比显著回升，说明利鲁唑对于PD模型鼠的Glu代谢转运障碍具有保护作用。

1996年即有研究者报道，利鲁唑在帕金森疾病模型鼠中具有保护性作用，利鲁唑降低了阿扑吗啡诱导的对侧旋转和苯丙胺诱导的同侧旋转，也可以减轻6-羟基多巴胺引起的黑质-纹状体多巴胺能神经元病变[19]。在2000年，Boireau等[20]检测了给予小鼠注射MPTP后，利鲁唑对小鼠纹状体内MPP(+)形成和积累的影响，发现利鲁唑并没有影响MPP(+)的积累，说明利鲁唑对MPTP毒性的保护作用并不是因为影响了MPTP在体内的代谢。Obinu等[21]通过给予帕金森病绒猴利鲁唑治疗后，发现利鲁唑治疗的绒猴保持了更好的运动功能和神经功能。利鲁唑可以保护多巴胺能神经元，并减少帕金森病模型中的行为缺陷。但是，目前关于利鲁唑对帕金森模型保护的具体机制的研究甚少，本研究着眼于机制学，证实了利鲁唑的神经保护功能，也发现了利鲁唑可通过EAAT1、EAAT2促进Glu的重新摄取，从而发挥PD保护作用。

综上所述，本研究重新探索了利鲁唑的其他治疗应用，从帕金森病的发病机制-纹状体区的Glu代谢转运异常出发，发现利鲁唑对PD小鼠纹状体区Glu过量堆积以及转运异常具有抑制作用，并认为通过保护EAAT1、EAAT2的数量及功能可以产生神经保护作用，在一定程度上为临床应用利鲁唑治疗帕金森病提供实验理论依据。